嗜酸乳杆菌发酵棉粕中细菌素的研究

■魏晓燕 张文举

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000)

近年来由于食品中抗生素的使用而引起的药物残留以及防腐剂添加超标而导致的各种损失,已引起了人们的广泛关注。人们迫切需要探寻一种能取代抗生素的抗菌剂,于是细菌素成为了近年来研究的热点。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)独特的生理、生化特性被认为是最理想的促生长替代抗生素的益生菌，其代谢产物细菌素以其无毒性、对热稳定，易被消化道中的蛋白酶降解，且低浓度下具有抑菌活性等特性，被认为是一种具有广阔应用前景的防腐剂和饲料添加剂[1-2]。

本研究以前期筛选出的产细菌素嗜酸乳杆菌为发酵菌株，分别发酵棉粕、豆粕，比较两者发酵后细菌素的活性，研究嗜酸乳杆菌发酵棉粕饲料中无机离子及不同干燥和保存方法对细菌素活性的影响，探索其在棉粕源发酵饲料中应用的可行性，为后续在饲料工业中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

棉粕、玉米由新疆石河子天康饲料有限公司提供，粉碎，过60目筛。

发酵菌种为筛选的产细菌素嗜酸乳杆菌(Lacto⁃bacillus acidophilus)J2。

指示菌为沙门氏菌(Salmonella)，由石河子大学微生物实验室提供。

培养基为营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、MRS琼脂培养基、MRS液体培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.2 仪器与设备

透析袋(1 000 u)、微型植物粉碎机（FZ-102）、针筒式滤膜过滤器(Ф 25/0.22 μm)、酸度计（PHSJ-3F型）、电子分析天秤(BS224型，精确至0.000 1 g)、精密电子天秤(SL 2002N型，精度0.01 g)、高压蒸汽灭菌锅(MLS-3750型）、恒温磁力搅拌器(HJ-3型)、电热鼓风干燥箱（GZX-9070MBE型）、台式真空冷冻干燥机(BT85B型)、真空包装机(DZ-400/2C型)、隔水式恒温培养箱(GSP-9246MBE型)、双人双面垂直洁净工作台(SW-CJ-2F型)、台式冷冻高速离心机(TG16G型)、高速冷冻离心机(himac CR226Ⅱ型)等。

1.2 方法

1.2.1 种子培养液制备

在无菌条件下，将嗜酸乳杆菌菌种划线培养于MRS固体培养基上，37℃培养36 h，从中挑取单个菌落接种于斜面培养基，37℃培养18 h，然后挑取一环接种于5 ml MRS肉汤培养基中，37℃静置培养16 h（一级菌种），再取2.5 ml一级菌种接入50 ml MRS肉汤培养基中，37℃培养11 h（二级菌种）作为发酵菌种。

1.2.2 样品处理

试验组样品处理：称取100 g发酵底物(棉粕90%、玉米10%)置于500 ml三角瓶中，按底物初水分30%加入纯化水，用玻璃棒搅拌均匀，密封，121℃蒸汽灭菌15 min，冷却后在无菌条件下接入5 ml(7.6×107cfu/ml)嗜酸乳杆菌二级种子液，搅拌均匀后转入100 ml无菌烧杯中，压实，用保鲜膜和橡皮筋密封，置于培养箱发酵培养48 h，发酵结束后称取10 g发酵样品溶于20 ml无菌水中(4 ℃、10 000 r/min、15 min)离心，取上清保存于4℃冰箱中。豆粕组样品处理与棉粕组相同。

对照组样品处理：将100 g试验底物置于500 ml三角瓶中混合均匀，然后加入30 ml的蒸馏水，充分搅拌调湿，pH值自然，在0.056 MPa、121℃条件下蒸汽灭菌20 min，冷却后装入样品袋，保存于4℃冰箱中待测。

1.2.3 细菌素的提取

采用Yang[3]的分离方法并加以改动：将上述处理液置70℃水浴锅中恒温水浴处理30 min，使酶失活；冷却至室温后用4 M NaOH溶液调pH值至6.0；室温电动搅拌30 min，使细菌素吸附在细胞上。离心（4 ℃、10 000 r/min、30 min），收集沉淀；将沉淀再次悬浮在5 mmol/l磷酸缓冲溶液100 ml中，进行二次洗涤。离心（4 ℃、10 000 r/min、30 min），收集沉淀；再将沉淀悬浮在100 mmol/l NaCI溶液5 ml中，用5%的H3PO4溶液调pH值为2.0；4℃电磁搅拌12 h，离心（4 ℃、10 000 r/min、15 min）收集上清液，并用细菌过滤器(孔径 0.22 μm)过滤；用截留分子量1 000 Da的透析袋在pH值3.1的柠檬酸缓冲液中透析过夜后进行抑菌试验。

单层琼脂平板打孔法[4]：取直径为90 mm的标准培养皿准确加入20 ml营养琼脂培养基，水平放置，使之形成均匀一致，冷却后4℃冰箱放置备用。吸取50 μl指示菌稀释液（活菌数为107cfu/ml）于固体培养基中，用灭菌推棒涂抹均匀，用直径为8 mm的无菌打孔器在平板上均匀打出扩散小孔，用无菌镊子将孔中菌层培养基夹出，准确量取200 μl的待测液加入到小孔中，放置37℃培养16 h至长出明显可见的抗菌圈，用游标卡尺测量其直径，每个试验设3个重复。

1.2.4 嗜酸乳杆菌发酵棉粕、豆粕细菌素活性的对比研究

嗜酸乳杆菌发酵棉粕：底料组成为棉粕90%、玉米10%，接种量为5.0 ml/100 g。温度为37℃，底物初水分30%，初始pH值6，发酵时间48 h。

嗜酸乳杆菌发酵豆粕：底料组成为豆粕90%、玉米10%，其他发酵参数如上。

1.2.5 嗜酸乳杆菌发酵棉粕中添加无机离子对细菌素产量的影响

无机离子对乳酸菌素的抑菌活性有一定影响，试验一拟采用4因子6水平均匀设计试验法优化底物中无机离子添加量。水平设置见表1。

表1 生物饲料无机离子添加量优化的因子与水平

根据SPSS 17.0统计软件中的均匀设计法得到4因子6水平均匀设计U6(64)(见表2)，利用此表来安排试验处理，每个处理3个重复，共计18个样本。试验测定指标为发酵产物中细菌素活性。

1.2.6 不同干燥方法和时间对细菌素活性的影响

对发酵后的棉粕饲料进行真空冷冻干燥和普通干燥处理。普通干燥以干燥温度、干燥时间为二个因素，每个处理设3个重复，普通干燥温度设置45、60、90、121 ℃ 4个梯度，干燥时间设置48、60、72 h三个梯度，每个处理设3个重复。以处理前底物中细菌素的活性为对照。测定不同的干燥温度和干燥时间细菌素的活性。统计分析试验结果，以细菌素活性最高的组合为优化结果。

表2 生物饲料无机离子添加量的优化均匀设计U6(64)

1.2.7 不同包装方法对细菌素活性的影响

采用真空包装（真空包装袋，10×15×16丝）、普通包装（PE封口袋、10×20×5丝）两种方法进行包装，每包装样50 g。测定干燥后饲料样品不同贮存时间对细菌素活性的影响。时间设置：10、20、30、40、50、60 d。每个处理设置3个重复，以0 d时细菌素活性作为对照，测定细菌素的活性。

1.2.8 指标测定方法

嗜酸乳杆菌数采用平板计数法，按照SN/T1941.1—2007《进出口食品中乳酸菌检验方法》进行计数。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel软件整理，使用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，试验数据用“平均值±标准差”来表示。

2 结果

2.1 嗜酸乳杆菌发酵棉粕、豆粕中细菌素活性的对比研究(见表3)

表3 不同底物发酵后抑菌活性及嗜酸乳杆菌活菌数的变化

以高压处理而未经发酵棉粕源底物为空白对照1组，未发酵豆粕源底物为空白对照2组，表3中可以得出，发酵后底物的活菌数与抑菌圈直径与对照组相比存在极显著差异(P＜0.01)。棉粕组与豆粕组之间抑菌圈直径差异不显著，这说明细菌素的产量主要取决于产生菌，不同发酵底物对细菌素活性变化无显著影响。

2.2 嗜酸乳杆菌发酵棉粕中添加无机离子对细菌素产量的影响

2.2.1 以L.acidophilus活菌数为因变量的回归分析

以L.acidophilus活菌数作为目标函数Y1，采用SPSS 17.0统计软件对表4中的活菌数和因子水平试验数据进行逐步回归分析，得到如下回归方程：

经逐步回归分析，该方程的确定系数R2=0.993，表明此回归方程能够准确表达各自变量与活菌数的关系，符合度较好。变量X2、X4与Y1呈负相关，标准偏回归系数分别为-0.155、-0.992；变量X3与Y1呈正相关，标准偏回归系数0.442；其中X1对活菌数含量差异不显著(P＞0.05)，X3的作用为差异显著(P＜0.05)，X4与Y1差异极显著(P＜0.01)。根据该回归方程，Y1最高指标时，各因变量组合为：X1(硫酸镁)0 mg/kg、X2(柠檬酸三铵)50 mg/kg、X3（硫酸锰）25 mg/kg、X4（磷酸氢二钾）50 mg/kg。

2.2.2 以抑菌圈直径为因变量的回归分析

以发酵产物中细菌素的抑菌圈直径作为目标函数Y2，进行逐步回归分析得到如下回归方程：

该方程的确定系数R2=0.977，表明此回归方程能够准确表达各自变量与抑菌圈直径的关系，符合度较好。各自变量与因变量Y2的标准偏回归系数分别为X2（0.880）、X3（-0.028）、X4（0.656）；其中X3对抑菌圈直径差异不显著(P＞0.05),X2、X4与Y2差异显著(P＜0.05)。根据该回归方程，Y2最高指标时，各因变量组合为：X1（硫酸镁）0 mg/kg、X2（柠檬酸三铵）300 mg/kg、X3（硫酸锰）0 mg/kg、X4（磷酸氢二钾）300 mg/kg。

2.2.3 无机离子添加量的确定(见表4)

经多重比较，各活菌数含量差异不显著，因此取抑菌圈直径为主指标，权重占90%，活菌数为次指标，权重占10%。嗜酸乳杆菌发酵棉粕中底物微量元素添加量比例如下：X1（硫酸镁）0 mg/kg、X2（柠檬酸三铵）275 mg/kg、X3（硫酸锰）2.5 mg/kg、X4（磷酸氢二钾）270 mg/kg。我们发现X1（硫酸镁）0 mg/kg的活菌数和抑菌圈直径两个指标的优化结论是一致的，都是取试验水平设置的最小值0。根据所确定的微量元素添加量比例和回归方程1、2，计算得出的发酵底物活菌数和抑菌圈直径预测值分别为：Y1=7.35×108cfu/g，Y2=15.43（mm）。

表4 生物蛋白饲料底物无机离子添加量的优化试验结果

2.3 不同干燥方法和时间对细菌素活性的影响（见表5）

表5 不同干燥方式对细菌素活性的影响

对发酵后的棉粕饲料进行真空冷冻干燥和电热鼓风干燥处理，以处理前底物中细菌素的活性为空白对照。由表5可以看出，发酵产物经真空冷冻干燥后细菌素的抑菌圈直径略高于普通电热干燥（45℃、48 h）组、（45 ℃、60 h）组、（60 ℃、48 h）组及对照组，但各组之间差异不显著。电热干燥处理下，干燥的温度和干燥时间对发酵产物中的抑菌活性均有影响，随着干燥时间的增加，各组的抑菌活性呈下降趋势。前期的研究可知细菌素是一种热稳定性物质，能够耐受121℃的高温，故本试验也设置了90、121℃这两个水平，可以看出在高温处理下产物中的细菌素仍具有一定的抑菌能力。综合考虑，由于真空冷冻干燥过程中消耗的能量较大、生产能力小、设备成本和维持成本都很高，且较高的烘干温度和时间都会破坏饲料的品质，故选取电热干燥45℃、48 h进行下一步试验。

2.4 不同包装方法对细菌素活性的影响（见图1）

采用真空包装、普通包装两种方法对干燥后的饲料样品进行分装，试验数据显示：采用真空包装处理，饲料样品的贮藏环境因与外界环境没有气体交换，故袋内细菌素活性在0～20 d范围内细菌素活性变化较平缓。30 d后，抑菌活性消失。普通包装组，随着贮存时间的延长，抑菌活性呈明显下降趋势，贮藏至20 d时，达到最低临界值。由图1可见，采用两种方法都存在随着储存时间的延长，活性不断下降的问题，但真空包装与普通包装相比，在延长细菌素的货架期方面具有较好优势。

图1 不同包装方法对细菌素抑菌活性的影响

3 讨论

3.1 微生物发酵对底物益生菌含量的影响

益生菌作为饲料添加剂要获得所预期的效果，活菌数需达到足够的数量。王小磊[5]利用复合菌种对棉粕源饲料进行发酵，发酵后酵母菌活菌数达2.2×108cfu/g，乳酸菌活菌数达2.3×108cfu/g，芽孢杆菌达18.4×108cfu/g。鲍振国[6]以枯草芽孢杆菌发酵棉粕源生物饲料，发酵结束后枯草芽孢杆菌菌数提高7.98×107cfu/g，差异均极显著（P＜0.01）。本研究所得的结果与前人的研究结果相似，活菌数较发酵前提高了一个数量级。

产细菌素嗜酸乳杆菌在发酵棉粕中原位表达细菌素，需要该乳酸菌能够适应特殊的发酵环境，使其能够在发酵饲料中发酵、加工和保藏过程中生长，并产生足够量的细菌素。原位产细菌素的抑菌效力还可能受到各种因素的负面影响，如细菌素结合于底物成分（脂肪或蛋白质颗粒）、蛋白酶或其他抑制剂可引起细菌素失活，溶解度和电荷的改变，目标细菌细胞膜的改变等。因此，细菌素在微生物发酵饲料中的应用有待进一步深入研究。

3.2 无机离子对细菌素产量的影响

无机离子对乳酸菌素的抑菌活性有一定影响。陈秀珠等[7]的研究表明，Mn2+对Nisin的产生有促进作用，而Cu2+则有强烈的抑制作用；Mg2+可增加细菌素pedio⁃cin AcH的产量。Koichi kuwano等[8]研究发现，Nisin Z在100 mM氯化钠的条件下对金黄色葡萄球菌的抑菌活性明显增强，因为高盐环境能够改变指示菌细胞膜的受体LipidⅡ的极性，增大了膜内外电位差，从而改变了指示菌细胞膜的通透性。乌云达来等[9]研究发现，柠檬酸三钠水合物对产生细菌素为负效应，即随着柠檬酸三钠水合物的添加量的增加细菌素产量呈下降趋势。本研究发现，柠檬酸三铵与抑菌圈直径为正相关。

3.3 不同干燥方法对细菌素活性的影响

饲料发酵后烘干主要是为了迅速降低发酵产生的大量水分，避免与空气接触污染变质，以便于包装、贮藏、运输、加工和使用。和常规干燥工艺比较，真空冷冻干燥在保持物料的物理化学特性和生物活性及营养成分方面具有非常明显的优势：冻干工艺对生物细胞和组织破坏极小，同时冻干工艺对生物细胞和组织破坏极小，在一定条件下容易吸水还原为原来的鲜活态。已有研究表明，应用冷冻干燥方法保存细菌、真菌、病毒等取得了显著的效果。但冻干工艺能耗高、设备控制难度大、操作成本也比其它干燥方法高出5～7倍[10]。因此，冻干技术的广泛应用受到很大限制。采用烘箱干燥，干燥速度较慢且消耗的能量比较高，但这种干燥方法操作容易控制。Ortwin Simon[11]认为嗜酸乳杆菌作为饲料添加剂的主要限制因素就是因为其耐热性差，在高温条件下存活率低，在饲料加工和储存过程中的稳定性很差。本研究发现，嗜酸乳杆菌发酵代谢产物细菌素具有较好的热稳定性，可耐受电热干燥（60℃、48 h），这一特性可保证其在热加工条件下，抵抗热破坏免于失活，拓宽了其作为饲料添加剂的前景。

3.4 不同包装方法对细菌素活性的影响

真空包装是指将产品装入气密性包装中，然后抽去包装内部的气体并密封，从而使密封后的包装内部达到预定真空度的一种包装方法。真空包装主要用于食品保鲜，通过使包装内部达到真空状态来抑制微生物生长，可使被包装物品达到隔氧、保鲜、防潮、防霉、防锈、防蚀、防虫、防污染等目的，有效地延长保质期、保鲜期，便于存放和运输[12]。本研究对比了2种包装方式下嗜酸乳杆菌发酵饲料中细菌素在不同贮藏时间下活性的变化规律，真空包装下数值的变化和相关报道的基本相似。研究结果说明，真空包装贮存细菌素的效果优于普通包装，真空包装是一种较好的保质贮藏方式。

4 结论

①细菌素的产量主要取决于产生菌，同一株菌发酵不同底物对细菌素活性变化无显著影响。

②底物微量元素添加量的优化结果为：X1（硫酸镁）0 mg/kg、X2（柠檬酸三铵）275 mg/kg、X3（硫酸锰）2.5 mg/kg、X4（磷酸氢二钾）270 mg/kg。

③ 真空冷冻干燥的抑菌效果优于电热干燥（45 ℃、48 h）、（45 ℃、60 h）、（60 ℃、48 h）组，各组之间差异不显著。

④真空包装与普通包装相比，在延长细菌素的贮存时间方面具有优势。