植物乳杆菌增殖培养基优化

■ 王 欣 赵 巍 付 丽甄玉国，2

（1.吉林农业大学吉农博瑞奶牛研发中心，吉林长春130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春130114）

乳酸菌是一类能将碳水化合物发酵且主要代谢产物为乳酸的革兰氏阳性菌[1]，在自然界分布广泛，种类繁多，是动物胃肠道的优势菌群，具有调节动物胃肠道菌群平衡、改善肠道内环境、增强免疫力和抵抗力等多种功能[2-7]，在食品、畜牧业及医药等领域得到了广泛应用。随着分子生物学研究技术的日益成熟，应用这类技术对乳酸菌的研究更加深入，这些研究加深了人们对于乳酸菌益生作用的认识，乳酸菌成为微生物学家和营养专家研究的热点。本文主要是通过对植物乳杆菌的培养基进行优化，从而使植物乳杆菌的菌体生物量达到最大，为乳酸菌的高密度发酵和工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

植物乳杆菌由中国微生物保藏中心提供。

1.2 培养基

种子培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖5.0 g、吐温80 1.0 ml、柠檬酸氢二铵2.0 g、无水乙酸钠 5.0 g、K2HPO42.0 g、MnSO4·H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、蒸馏水1.0 L，pH值6.8。

MRS固体培养基[8]：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、无水乙酸钠5.0 g、柠檬酸氢二铵 2.0 g、Tween80 1.0 ml、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、CaCO320.0 g、琼脂18.0 g、蒸馏水1.0 L，pH值6.8。

MRS液体培养基[8]：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 ml、柠檬酸氢二铵2.0 g、无水乙酸钠5.0 g、K2HPO42.0 g、MnSO4·H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、蒸馏水 1.0 L，pH 值6.8。

1.3 乳酸菌生长曲线绘制

取斜面菌种一环，接入MRS液体培养基中，37℃培养24 h，活化两代。将活化后的乳酸菌，接入400 ml MRS液体培养基中，接种量为2%。将接入菌体的液体培养基摇匀后分装于10 ml EP管中，每管5 ml，置于37℃的培养箱中静置培养。每隔2 h取三支EP管置4℃冰箱保存。待EP管全部取完后，用722分光光度计在光程为1 cm、波长为600 nm测量吸光度值，以同一批次灭菌而未接入菌种的MRS液体培养基为参比，绘制菌体生长曲线。

1.4 培养基成分的优化

1.4.1 碳源及其添加量的筛选

选取葡萄糖、乳糖、蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉为碳源，仍以2%的添加量替代MRS培养基中的碳源，培养16 h后，用722分光光度计在600 nm的条件下测定OD值，用酸度计测定pH值。将最佳碳源分别以1%、1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%、4.0%、4.5%的添加量加入MRS培养基中，37℃静置培养16 h，测定OD值。

1.4.2 氮源及其添加量的筛选

选取硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨和牛肉膏组合（1∶1）为氮源，按照MRS培养基中氮的含量和以上每种物质中所含的总氮量分别折算氮源的添加量。37℃培养16 h，测定OD值。将最佳氮源分别以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的添加量加入MRS培养基中，37℃静置培养16 h，测定OD值。

1.4.3 各种无机盐、刺激因子、缓冲盐及其添加量的筛选

将MRS中的无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、MnSO4·H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O和吐温80分别单一加入培养基中，通过测定OD值，得出各种无机盐及刺激因子对乳酸菌繁殖速率的相关性。依据各种无机盐、刺激因子及缓冲盐对乳酸菌繁殖快慢的影响，对各种物质的添加量进行筛选。

1.4.4 正交试验

考虑到各个因素之间的互作作用，选取葡萄糖、蛋白胨和MnSO4·H2O三个因素为主要因素，进行L9(33)正交试验设计。

1.5 统计分析

用Excel将不同培养基成分对植物乳杆菌OD值和pH值的影响进行整理，通过SPSS 17.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌生长曲线绘制（见图1）

图1 植物乳杆菌的生长曲线和pH值变化曲线

通过生长曲线我们可以看出，随着培养时间的增加，植物乳杆菌的生物量在迅速增长，在4 h进入对数期，到达16 h进入稳定期，24 h以后OD值略有下降，可能是由于一部分细菌发生菌体自溶。pH值的变化和植物乳杆菌的生物量变化是相符合的，由于植物乳杆菌发酵过程中产生乳酸，所以，随着培养时间的增加，pH值急剧下降，当培养到16 h，pH值下降幅度减小，逐渐趋于稳定。由于发酵产物中积累了大量的乳酸抑制了乳酸菌的繁殖，所以pH值的下降幅度会减小。

2.2 不同碳源对植物乳杆菌OD值的影响（见图2）

图2 不同碳源对植物乳杆菌OD值的影响

如图2所示，植物乳杆菌的最佳碳源为葡萄糖，其次为蔗糖，再次为糖蜜，淀粉不能被植物乳杆菌有效利用，因为淀粉为多糖，乳酸菌在利用的过程中需要水解成单糖后才可以吸收利用。乳酸菌本身缺乏分泌分解淀粉的酶，所以对淀粉的利用效果最差；而葡萄糖作为碳源对植物乳杆菌的生长促进作用明显，而淀粉不能有效促进植物乳杆菌的生长。葡萄糖为速效利用碳源，属于单糖，可以被乳酸菌直接利用，迅速提高菌体的生物量。

2.3 葡萄糖最佳添加量的筛选（见图3）

图3 葡萄糖添加量对植物乳杆菌OD值的影响

随着葡萄糖添加量的增加，OD值逐渐增大，当添加量达到3.0%，OD值达到最大；再增加葡萄糖的量，OD值又逐渐减小，但降低的幅度不明显。葡萄糖的添加量在3.0%处出现拐点，所以葡萄糖的最佳添加量为3.0%。

2.4 不同氮源对植物乳杆菌的影响（见图4）

图4 不同氮源对植物乳杆菌OD值的影响

由图4中可以看出，牛肉膏和蛋白胨为有机氮源，能够有效促进植物乳杆菌的生长，而植物乳杆菌对于无机氮源的利用效果较差。由于乳酸菌合成蛋白和分解蛋白的能力都比较差，不易利用无机氮源，而有机氮源中含有丰富的氨基酸比较容易被吸收，所以能有效提高植物乳杆菌的菌体生物量。单独使用蛋白胨与混合牛肉膏使用对植物乳杆菌的效果一样，考虑到成本问题，选用蛋白胨为植物乳杆菌的氮源。

2.5 蛋白胨最适添加量的筛选（见图5）

图5 蛋白胨添加量对植物乳杆菌OD值的影响

选择蛋白胨的添加量为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，培养16 h后，测定OD值。

如图5显示，随着蛋白胨添加量的增加，植物乳杆菌的OD值在不断增加，在3.0%处出现拐点，所以蛋白胨的最适添加量为3.0%。

2.6 不同无机盐、刺激因子及缓冲盐对植物乳杆菌OD值的影响（见图6）

图6 不同无机盐对植物乳杆菌OD值的影响

在以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源的培养基中依次单一加入无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4和吐温80进行试验，以不加以上的无机盐、刺激因子和缓冲盐为对照组。结果表明，添加无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、MnSO4·H2O和吐温80对乳酸菌的增殖有促进作用，其中MnSO4·H2O对植物乳杆菌菌的增殖效果最为明显，其次为无水乙酸钠，而硫酸镁和磷酸氢二钾对植物乳杆菌的促进作用不大。

2.6.1 硫酸锰最适添加量的筛选（见图7）

图7 硫酸锰添加量对植物乳杆菌OD值的影响

在以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源的培养基中，依次加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/l的硫酸锰，以不加硫酸锰作为对照。结果表明，在培养基中添加0.05 g/l的硫酸锰对植物乳杆菌的促进作用最强，所以硫酸锰的添加量为0.05 g/l。

2.6.2 无水乙酸钠最适添加量的筛选（见图8）

图8 无水乙酸钠添加量对植物乳杆菌OD值的影响

在以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、加入硫酸锰0.05 g/l的培养基中，依次加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的无水乙酸钠，不添加无水乙酸钠为对照。结果表明，1.4%的无水乙酸钠对植物乳杆菌的促进作用最为明显。

2.6.3 柠檬酸氢二铵最适添加量的筛选（见图9）

图9 柠檬酸氢二铵添加量对植物乳杆菌OD值的影响

与筛选硫酸锰和无水乙酸钠同样的道理筛选柠檬酸氢二铵。结果表明：随着柠檬酸氢二铵浓度增加，植物乳杆菌的浓度随之增加，在0.5%时达到最大，继续增加柠檬酸氢二铵浓度，菌体浓度逐渐下降。可能的原因是柠檬酸氢二铵对植物乳杆菌的糖酵解途径的关键酶——磷酸果糖激酶具有调节作用，柠檬酸对磷酸果糖激酶具有抑制作用，而可以解除柠檬酸的抑制作用。

2.6.4 吐温80最适添加量的筛选（见图10）

吐温80作为一种刺激物质，对植物乳杆菌的增殖作用不是很大，但是在培养基中添加吐温80对代谢产物中产生特定的代谢产物有一定作用，由图10可知，吐温80的最佳添加量为0.40%。

图10 吐温80对植物乳杆菌OD值的影响

2.7 酵母粉最适添加量的筛选（见图11）

图11 酵母粉对植物乳杆菌OD值的影响

酵母浸粉中含有丰富的维生素和生长因子，在培养基中添加少量酵母粉对细菌的繁殖有促进作用，由图11可知，添加1.0%的酵母浸粉对植物乳杆菌的促进作用最好，在此添加量出现拐点。

2.8 正交试验

正交试验设计见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验设计

由正交试验结果可知，从R值可以看出，影响植物乳杆菌OD值的主次顺序为A＞C＞B，因此，植物乳杆菌发酵培养基的最优培养基组合为A2B2C3，即葡萄糖的添加量为3.0%、蛋白胨添加量为3.0%、硫酸锰的添加量为0.07 g/l。从R值可以看出，培养基中的葡萄糖对OD值影响最大，综合考虑发酵条件的互作效应，植物乳杆菌发酵培养基的最优组合为葡萄糖3.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉1%、无水乙酸钠1.4%、柠檬酸氢二铵 0.5%、MnSO4·H2O 0.07 g/l、MgSO4·7H2O 0.2%、K2HPO40.2%、吐温80 0.4%。在此条件下进行验证试验，OD值提高到17.258，大约是优化前的2倍。

表2 正交试验结果

3 讨论

3.1 碳源对植物乳杆菌菌体生物量的影响

碳源是微生物繁殖过程中的主要物质之一，是构成细胞物质的基础，为微生物繁殖过程中提供大量的能源。如果碳源合适则乳酸菌吸收和利用碳源比较容易，从而节省了大量的能量，有利于菌体生长；反之，乳酸菌吸收和利用碳源时要消耗大量的能量，不利于乳酸菌的增殖。徐洪伟等[9]研究了不同碳源、氮源对乳酸杆菌小分子肽产量及抑菌效果的影响，结果表明葡萄糖为碳源的发酵液的生物量最大。梁璋成等[10]对植物乳杆菌R23进行了培养基的优化，结果指出植物乳杆菌最佳碳源为葡萄糖。Lovijesteijn等[11]研究指出，德氏保加利亚乳杆菌NCFB2772以葡萄糖为碳源比以果糖为碳源时产胞外多糖的量提高2倍。本试验选用葡糖糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、淀粉等作为碳源，结果表明，3%的葡萄糖对植物乳杆菌的增殖作用最好，结果与前人研究相一致。葡萄糖是细胞的供能物质和主要的碳源物质，不同碳源相比较，葡萄糖为单糖而且是速效利用碳源，而淀粉为多糖需要分解为单糖或二糖才能被利用[12]。当然，不同种属的乳酸菌对碳源的种类要求不同，不同的研究需要的代谢产物不同而需选择不同的碳源。

3.2 氮源对植物乳杆菌菌体生物量的影响

用于培养乳酸菌的氮源有很多，包括有机氮源和无机氮源。氮是微生物生长发育过程中组成核酸和蛋白质的重要元素，对微生物的生长发育有着重要作用。实验室常用于培养乳酸菌的培养基有MRS、CM和M17，而这三种培养基的共同特点是氮源由多种有机氮源混合提供。从试验结果看出，植物乳杆菌对无机氮源的利用效果差，因为植物乳杆菌对氮源要求比较苛刻，必须吸收利用多种有机氮源中的氨基酸和生长因子才能有效促进植物乳杆菌的生长，所以最终选择3.0%的蛋白胨提供氮源。

3.3 无机盐对植物乳杆菌菌体生物量的影响

无机盐也是细菌生长不可缺少的物质，无机盐的主要作用是维持菌体的渗透压，另一方面一些离子对细菌体内的酶有激活作用。乳酸菌在代谢过程中产生乳酸使pH值下降，故培养基中需要加入一些缓冲盐来调节pH值，维持渗透压，从而使乳酸菌更好地生长。梁璋成等[10]报道在培养基中引入0.05 g/l MnSO4菌量比无锰培养基高2倍左右，可能是因为Mn2+是葡萄糖激酶、醛缩酶、变位酶、磷酸烯醇化酶、丙酮酸激酶等主要酶的激活剂。陈秀珠等[13]的研究显示，Mn2+对Nisin的产生有促进作用，Cu2+则有强烈的抑制作用；Mg2+可增加细菌素Pediocin AcH的产量。本试验对多种无机盐进行筛选，结果显示，硫酸锰和无水乙酸钠对植物乳杆菌的生长促进作用较大，此结果与梁璋成报道相一致。而磷酸氢二钾、硫酸镁和柠檬酸氢二铵对植物乳杆菌的生长促进作用不明显，但是考虑到Mg2+和磷是很多酶的激活剂，对产生某种特定的代谢产物起一定的作用，所以在培养基中加入了少量的Mg2+和P。

3.4 刺激因子对植物乳杆菌菌体生物量的影响

Garver[14]等研究发现，在MRS培养基中添加Tween80对细菌的生长无明显影响，但添加Tween80乳酸菌代谢物中会产生弯曲乳杆菌素（Curvaticin FS47）。在培养基中添加1%的Tween80可提高乳酸乳球菌乳脂亚种J46的细菌素产量，但是增加到2%时，对其产量并无影响。庄绪亮等[15]研究了不同发酵条件下Tween80对乳酸链球菌SM526产Nisin的影响，结果表明，在pH值为7.0发酵条件下，Tween80对乳酸链球菌SM526产Nisin都有一定的提高作用。本试验在培养基中加入了0.4%的吐温80，对植物乳杆菌的生长作用并不是很大，但添加吐温80主要是考虑吐温80对细菌素的产生有一定的促进作用，为后期厌氧培养奠定基础。

4 结论

①植物乳杆菌的最佳增殖培养基为葡萄糖3.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉1%、无水乙酸钠1.4%、柠檬酸氢二铵 0.5%、MnSO4·H2O 0.07 g/l、MgSO4·7H2O 0.2%、K2HPO40.2%、吐温80 0.4%，OD600值从9.428提高到了17.258。

②在培养基中加入Mn2+比不加Mn2+乳酸菌菌体的OD值提高了将近2倍（见图6）。