5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌抑菌效果的比较

■马玉和 王庆奎 郭永军 尤宏争 孙学亮 成 希

（1.天津海升水产养殖有限公司，天津 300270；2.天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；3.天津市水产研究所，天津 300221）

嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌广泛存在于自然环境中，是鱼类常见的致病菌。其中，致病性嗜水气单胞菌可感染人和各种动物。目前对由嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌感染引起的水产动物相关疾病的防控和治疗，仍主要依赖传统的化学消毒剂、抗生素。长期使用这些药物，不仅使致病菌的耐药性不断增强，而且也导致养殖动物体内药物残留量日趋增多，最终因药物积蓄而导致鱼类以及水环境被污染[1]。近年来，大量研究表明，中草药可以用于防治细菌性传染病。中草药是一种天然环保型绿色药物，具有高效、毒副作用少、安全性高、残留少等诸多优点。目前，用中草药代替抗生素是水产病害防治的发展趋势，因此研究中草药对致病菌的作用效果、抑制杀灭机理等具有重要的意义。

有关中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌抑制作用研究比较多[2-6]。本试验通过五种中草药的抑菌试验，研究五种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的影响，旨在寻求一种健康绿色的药物来治疗迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌引发的疾病，并以此指导生产，为细菌性疾病防治提供参考依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌及菌液制备

本试验迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌是由天津农学院天津市水产生态及养殖重点实验室提供。将其分别涂布于营养琼脂培养基上，放入恒温培养箱中培养24 h，然后用生理盐水冲洗培养基获得菌液，放入4℃冰箱中保存供试验使用。之后使用时以生理盐水稀释，用麦氏浊度仪确定菌液浊度为0.5。

1.1.2 M-H培养基与中草药

M-H培养基为天津市水产生态及养殖重点实验室提供。

五倍子(Rhus chinensis)、黄芩(Scutellaria baicalensis)、诃子（Terminalia chebula）、乌梅（Prunus mume）、石榴皮（Punica granatum）五种中草药购自天津市某大药房，将中草药粉碎装于封口塑料袋中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 试验药物的制备

五倍子、黄芩、诃子、乌梅、石榴皮五种中草药各取10 g放入烧杯中，各加200 ml的蒸馏水，浸泡30 min后加热煎煮，边煮边用玻璃棒搅动，待煮沸后用文火煮30 min，过滤出药液，然后再加水煎煮，共煎煮三次。合并三次所得药液，再次过滤出杂质后，加热浓缩至1 g/ml，放入4℃冰箱中保存供试验使用，使用前充分振荡。

1.2.2 试验药敏纸片的制备

用打孔器在滤纸上打孔，制备直径为6 mm的圆形滤纸片，放试管中经高压灭菌锅灭菌，烘干。烘干后，在超净工作台中，将滤纸片放入培养皿中，分别吸取5种药液加入其中，同时加蒸馏水作空白对照组，共6组，充分浸泡吸收，制成药敏纸片，每片纸片的含药量约为10 mg。

1.2.3 药物抑菌试验设计

采用纸片琼脂扩散法(K-B纸片扩散法)，分别配制添加不同盐度卤水的M-H培养基（迟缓爱德华氏菌组为0、10、20、30、40；嗜水气单胞菌组为0、1、2、3、4），在M-H培养基上，分别取100 μl菌悬液均匀涂布于平板，用灭菌镊子以无菌操作取出制备好的中草药药敏纸片贴在涂布有细菌的平板培养基表面,贴片时轻轻按压,使药片与培养基密切接触。每个平板上贴五个药敏纸片，然后放入恒温培养箱中，在28℃条件下培养24 h，然后测定抑菌圈的直径，记录，每个抑菌圈在两个方向各测量两次，取其平均值。中草药抑菌效果等级划分：抑菌圈直径小于8 mm为无抑菌作用；8～11 mm为弱抑菌作用；11～16 mm为中等抑菌作用；16 mm以上为强抑菌作用。

1.2.4 数据处理与统计分析

数据用SPSS软件做单因素方差分析，差异显著者用Duncan's法做多重比较，显著性水平为P＜0.05。表中数据用“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 不同盐度下5种中草药对迟缓爱德华氏菌的抑菌直径比较（见表1）

表1 不同盐度下5种中草药对迟缓爱德华氏菌的抑菌直径比较

由表1可知，不同盐度下5种中草药对迟缓爱德华氏菌的抑菌直径可以看出，在其它条件相同，盐度不同的情况下，抑菌圈的情况也有明显不同。其中在添加盐度为0时，对迟缓爱德华氏菌的抑制作用由强到弱依次为五倍子、诃子、黄芩、乌梅、石榴皮；在添加盐度为10时依次为五倍子、诃子、石榴皮、乌梅、黄芩。而在添加盐度为20时，依次为诃子、五倍子、石榴皮、黄芩、乌梅；在添加盐度为30时，抑制作用由强到弱依次为诃子、五倍子、石榴皮、乌梅、黄芩；在添加盐度为40时，则是诃子、乌梅、黄芩、五倍子、石榴皮。由此表明：对于相同盐度，低盐条件下，五倍子的抑菌作用明显强于其它四种，而在高盐条件下，诃子的抑菌作用要明显强于其它四种。随着盐度的增加，这五种中草药对迟缓爱德华氏菌的抑制作用都有所增强，抑菌圈直径大于11.00 mm，抑菌效果明显，以诃子最为明显。不同盐度条件下，五倍子、诃子、黄芩具有明显抑菌作用，抑菌圈直径在都11 mm以上。

2.2 不同盐度下5种中草药对嗜水气单胞菌的抑菌直径比较（见表2）

表2 不同盐度下5种中草药对嗜水气单胞菌的抑菌直径比较

由表2可知，不同盐度下5种中草药对嗜水气单胞菌的抑菌直径可以看出，在其它条件相同，盐度不同的情况下，抑菌圈的情况也有明显不同。其中在添加盐度为0时，对嗜水气单胞菌的抑制作用由强到弱依次为五倍子、石榴皮、诃子、黄芩、乌梅；在添加盐度为1时依次为五倍子、石榴皮、诃子、乌梅、黄芩。而在添加盐度为2时，依次为五倍子、诃子、乌梅、石榴皮、黄芩；在添加盐度为3时，抑制作用由强到弱依次为五倍子、石榴皮、乌梅、黄芩、诃子；在添加盐度为4时，则是五倍子、乌梅、诃子、石榴皮、黄芩。由表2可知，在不同盐度条件下，五倍子的抑菌作用都明显强于其它四种，抑菌圈大于14 mm。其它四种中草药抑菌效果较弱，抑菌圈小于10.00 mm。乌梅对嗜水气单胞菌的抑制作用有所增强。

3 讨论

3.1 同一盐度下中草药对致病菌抑菌效果的比较

对于迟缓爱德华氏菌，M-H培养基添加不同盐度卤水分别为0、10、20、30、40五个梯度。从表1可知，在0、10盐度条件下，五倍子的抑菌作用明显强于其它四种，而在20、30、40盐度条件下，诃子的抑菌作用要明显强于其它四种中草药。对于嗜水气单胞菌，M-H培养基添加不同盐度卤水分别为0、1、2、3、4五个梯度。从表2可以看到，在相同盐度条件下，五倍子的抑菌作用都明显强于其它四种，抑菌圈大于14.00 mm。5种中草药对两种菌的抑菌比较，从表1和表2中可见，对于同一盐度下，5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌圈可以看出：在相同条件下，5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均存在不同程度的抑制作用。其中五倍子对这两种细菌都具有较强的抑制作用，而诃子和黄芩对迟缓爱德华氏菌具有明显抑菌效果，抑菌圈直径均大于11.00 mm；对嗜水气单胞菌效果却一般。石榴皮和乌梅的抑菌效果一般，乌梅对迟缓爱德华氏菌的抑制作用则强于嗜水气单胞菌。

3.2 不同盐度对中草药抑菌效果的影响

对于迟缓爱德华氏菌，随着盐度的增加，这五种中草药的抑制作用都有所增强，抑菌效果明显，其中以诃子最为明显。不同盐度条件下，五倍子、诃子、黄芩具有明显抑菌作用，抑菌圈都在11 mm以上。对于嗜水气单胞菌，在不同盐度下五倍子的抑菌作用都明显强于其它四种；随着盐度的增加，乌梅的抑制作用有所增强，而其它四种都有所减弱。上述结果的出现，可能是由中草药的药性所决定的，五倍子对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均具有较好的抑菌和杀菌效果。在上述试验中，虽然盐度增加，但五倍子的抑菌效果依然明显。其它四种则表现不一，或随盐度增长抑菌效果增强，或随盐度增长而减弱。

3.3 不同中草药抑菌试验研究方法对抑菌效果的影响

本试验以迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌供试菌，用5种中草药煎液对其进行了抑菌试验。在相同条件下，迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌对不同的中草药煎液的耐受程度存在较大差异。其中五倍子对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均具有较好的抑菌和杀菌效果；诃子和黄芩对迟缓爱德华氏菌具有明显抑菌效果，对嗜水气单胞菌效果却一般。这与姜巨峰等[6]研究中草药试验中五倍子对嗜水气单胞菌有较强的抑菌效果、陈言峰等[7]研究中草药对迟缓爱德华氏菌的体外抗菌活性试验中五倍子抑菌作用明显的结论一致。这些结果的出现，可能与中草药的药性有关，五倍子富含鞣质，能够凝固微生物体内的原生质，同时含有多种酶能够对多种细菌起抑制作用[8]。

研究中草药抑菌效果有多种方法，如体外法、体内法，还有攻毒试验等研究方法；体内法又分为喂食、注射、药浴等；而攻毒试验也可分先感染再治疗，先预防再感染两种。中草药的提取工艺也可分为多种，如水温浸法、稀碱（酸）溶液温浸法、乙醇回流法等，不同的提取工艺对研究试验结果也会产生很大影响[9]。本试验中草药提纯采用水煎法，多次煎煮可能会对中草药中所含活性物质造成破坏。关于这几种中草药的醇提物对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果是否相同，尚需进一步研究讨论。测定中草药抑菌强弱的方法有琼脂扩散法和二倍稀释测最小抑菌和最小杀菌浓度法等。本试验采用琼脂扩散法(K-B纸片扩散法)，在M-H培养基上进行试验，M-H培养基能大大提高抑菌试验的灵敏度，避免以往所用营养琼脂中某些成分与中草药抗菌物质结合而钝化药物的抗菌作用[10]。

本试验通过将5种中草药五倍子、乌梅、石榴皮、黄芩和诃子分别制成药敏纸片，然后进行药敏纸片抑菌试验，结果表明：五倍子对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均具有较好的抑菌和杀菌效果，在不同盐度条件下效果都比较稳定，所以可以作为一种海水、淡水环境下通用药物来开发使用。随着盐度的增加，五种中草药对迟缓爱德华氏菌的抑制作用都有所增强，以诃子最为明显。其对嗜水气单胞菌则表现不一，或随盐度增长抑菌效果增强，或随盐度增长而减弱的。在不同盐度条件下，同种中草药对同种细菌具有不同的抑制和杀灭作用，这可以为针对特定盐度环境的水体，开发高效药物提供依据；同时也可确定药物的最佳使用环境条件，防止不必要的浪费及影响养殖生产。