复合酸化剂体外模拟消化试验设计

■王 彤 刘显军 陈 静

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866）

对于幼龄动物(如仔猪），由于自身消化系统发育不健全，导致胃液和各种消化酶分泌不足，需要依靠外界提供一定的酸化环境以利于改善肠道微生物区系、提高内源酶活性，从而维持动物健康生长。虽然酸化剂具有无污染、无残留，在体内吸收迅速等特点，但各种酸化剂在动物体内的作用程度各异。研究最佳的酸化剂配合比例，从而达到最佳的酸化效果尤为重要。因此，如何科学做好酸化剂体外模拟消化试验设计，对复合酸化剂的应用与发展具有重要的现实意义。

1 试验设计的意义

动物试验能够对饲料酸化剂营养价值进行评定，但这些方法往往耗时、费力，很难在短时间内对大量的饲料酸化剂样品进行分析评价。主要有以下几方面原因造成：一是试验动物本身个体存在差异造成试验产生误差，比如很难选择相同品种、体重和遗传性同时具备的试验动物进行分组试验；二是因不同的饲养方式、饲养员的投食喜好、圈舍条件采光、温度、湿度等饲养管理因素产生试验结果差异；三是大量的试验往往不能在自然环境相同的条件下同期内完成，造成不同时期试验结果存在差异；四是试验动物个体的原因，无法确定其是否由于疾病还是由于技术操作造成试验结果误差。所以，用动物试验进行酸化剂使用效果评价，会因生物学影响因素多、结果变异大、重复性差等因素而限制其的应用性。随着动物消化生理研究的深入和技术手段的创新，利用动物体外消化模拟技术来研究饲料的营养价值已经成为可能。因此，本试验设计本着可重复和试验条件一致性原则，严格控制各种干扰因素，做好复合酸化剂动物体外模拟试验设计，最大可能控制好活体生物自身生长等非试验因素的影响，科学统计、分析试验结果并做出结论，从而提高试验可靠度。如果试验设计不合理、考虑不周全、不可控影响因素过多，不仅不能得到预期结果，而且可能造成整个试验的失败。因此，做好体外模拟试验设计是研究复合酸化剂体外模拟消化试验工作成功与否的关键。

2 试验设计的基本方法

体外模拟试验分为[1-5]单酶法（一步法）和多酶法，单酶法主要测定pH值及养分消化率法，其中测定pH值又包括了pH值变化幅度法和pH值恒定法；多酶法主要分为两段法、三段法及其它（消化道食糜）。随着对畜禽消化生理的深入研究，单胃动物体外消化模拟技术也得到了发展，已由过去的单一酶法发展为现代的多酶法。多酶法不但对胃消化过程进行模拟，而且还对胰腺分泌消化酶、小肠消化以及大肠微生物消化等过程进行模拟，即由几种消化酶同时完成畜禽体内消化过程。相比之下，三段法明显优于二段法和一步法，其原因主要在于酶成分更复杂、测定结果更精确、测定成分及种类更多，它不但可以用来预测蛋白质的消化率，而且可以用来预测淀粉、脂肪、钙、磷、粗灰分、粗纤维等消化率；使可评价的指标范围变宽，应用更加广泛；而且测定环境易于标准化，稳定性高；实验室之间可比性强。不但可以测定某一时间点的降解率，还可以测定饲料动态降解率。

Boisen等[7]利用胃蛋白酶-胰酶-碳水化合物酶法测定的90个饲料样品和30种配合饲料的体外有机物质消化率与猪体内消化能之间存在线性相关(R2=0.94)。这两种方法所获得的干物质和能量消化率结果表现出很强的一致性。这表明利用胃蛋白酶-胰酶-碳水化合物酶三步法能够预测猪饲料的消化能。

3 体外模拟试验设计

3.1 试验一

根据不同比例调配出不同类型的复合型酸化剂，测定加入不同复合型酸化剂之后日粮的pH值、系酸力、电解质平衡、缓冲能力、缓释能力，采用均匀设计方法，通过逐步回归方程计算出复合型酸化剂的最佳配方。复合型酸化剂最优配比试验技术路线见图1。

3.2 试验二

通过打孔法测量复合型酸化剂的抑菌直径，研究复合型酸化剂在体外对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌的抑制作用，测定抑菌圈直径。采用二倍稀释法测定复合型酸化剂的最小抑菌浓度。体外模拟消化试验测定消化后食糜内的微生物菌群、消化酶活性、食糜上清液中挥发性脂肪酸的含量。测定营养物质消化率，包括干物质消化率、能量消化率、粗蛋白消化率、Ca和P吸收率、氨基酸(AA)消化率。

图1 复合型酸化剂最优配比试验技术路线

3.3 试验三

根据求得的最佳配比配置复合型酸化剂，分别设定三个浓度梯度进行体外模拟消化试验，每个浓度梯度三个重复。通过三段法（即胃蛋白酶-胰酶-碳水化合物酶法），体外模拟动物消化，综合测定日粮中添加复合型酸化剂后，食糜的微生物菌群、消化酶活性的影响、食糜上清液中挥发性脂肪酸的含量以及营养物质消化率，包括干物质消化率、能量消化率、粗蛋白消化率、Ca和P吸收率、AA消化率，为生产实践提供依据。

4 数据的统计与分析

不同酸的比例采用均匀设计的方法，研究出复合型酸化剂的最佳配方，在实验室中通过对常见细菌的抑菌试验、饲料酸结合力和动物体外模拟消化试验来证明这几种酸化剂的抑菌效果和最佳配比及添加浓度，用来在生产中指导实践。数据先用Excel进行数据初步分析，SPSS 10.0中的One-Way ANOVA进行方差分析和Duncan's法多重比较，对试验数据进行统计分析。体外模拟复合型酸化剂的抑菌试验及消化试验技术路线见图2。

5 试验设计中应注意的问题

为保证体外模拟试验的准确性和精确性，在试验设计时应注意以下事项。

①在实验室做抑菌试验时，全程需在无菌操作台上工作，避免杂菌干扰抑菌效果，保证试验结果的准确性。同时，因个人操作和仪器设备等因素，偶然性很大，需重复多做来避免误差。

图2 体外模拟复合型酸化剂的抑菌试验及消化试验技术路线

②体外消化模拟方法中的各项消化参数可能只是部分参数与体内实际情况相吻合，如消化道pH值、温度、消化酶种类与水平、消化时间等。而一些参数则相差较远，如胃肠道内微生物群、黏膜脱落细胞、消化产物的相互作用、营养物质代谢水平等。因此，需要多次进行试验，将可控制因素标准化，不可控因素力求准确，提高试验准确度。

③体外模拟会因个人操作不同而有差异，极大程度上受温度、反应时间、酶浓度的影响，最佳解决方案就是大量重复试验，及时发现试验方案中的不足，并加以改正。

④为避免可能存在的消化产物对酶促反应的抑制作用，消化终产物应尽快与未消化物质分离，最大程度模拟畜禽消化。

⑤注意试验样品重量和粒度、粉碎程度等物理因素对营养物质消化率的影响，试验饲料应选用基础日粮，避免其它饲料添加剂干扰试验结果，提高营养成分消化率的准确程度。