沼泽红假单胞菌发酵培养条件优化研究

■ 刘德海 陈国参 解复红 胡宜亮 周伏忠 马 焕 庞向宇

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州 450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南郑州 450008；3.河南省微生物工程重点实验室，河南郑州 450008）

沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）是光合细菌（Photosynthetic Bacteria,简称PSB）的代表菌株之一。在生物学分类中，按照东秀珠（2001）《常见细菌系统鉴定手册》分类[1]，属于原核生物，真细菌中的光合细菌将不产氧光合细菌分为着色杆菌科（Chromatiaceae）、外硫红螺菌科（Ectothiorhodospiraceae）、紫色非硫细菌（purple nonsulfur bacteria）、绿色硫细菌（green sulfur bacteria）、多细胞丝状绿细菌（multicellular filamentous green bacteria）、螺旋杆菌科（Helicobacteraceae）含细菌叶绿素的专性好氧菌（bacteriochlorophylla-containing aerobic bacteria）等七大类群，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)属于紫色非硫细菌（purple nonsulfur bacteria）、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)中的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。根据中华人民共和国农业部公告第2045号公布的允许使用的饲料添加剂品种目录中，饲料级微生物添加剂有34种，允许使用的饲料级微生物中，沼泽红假单胞菌就在其内。目前，沼泽红假单胞菌作为养殖水质净化剂，早已广泛应用于水产养殖中，可有效降低对虾养殖废水中的COD，并取得了显著效果。沼泽红假单胞菌其菌体含有较高含量的蛋白质、维生素、类胡萝卜素等营养物质，可作为饲料添加剂用于经济动物的养殖；用于鱼、虾、贝的培育，作为动物性饵料的饵料，具有防病、治病作用等多方面的应用价值[2-5]。

近年来，杜冰等（2007）对沼泽红假单胞菌的生长条件进行了研究[6]，发现pH值、温度、接种量等因素影响沼泽红假单胞菌的生长，并且它们之间又相互影响。夏冰冰等（2010）对沼泽红假单胞菌发酵条件进行了响应面优化研究[7]。全亚玲等（2012）对沼泽红假单胞菌发酵培养基配方及培养条件进行了优化研究[8]，采用单因素试验设计分别对本实验室保藏的沼泽红假单胞菌培养的接种量、pH值、温度、光照强度四种因素的不同水平进行比较试验，确定其各自最佳试验水平；确定了最佳培养基组成配方。本试验旨在对实验室保藏的沼泽红假单胞菌R1菌株的培养基配方以及培养条件进行优化，简化生产配方，降低生产成本，以期为产业化生产沼泽红假单胞菌R1菌剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

沼泽红假单胞菌R1：由河南省微生物工程重点实验室保藏。

1.1.2 培养基

菌种保藏培养基(ATYP琼脂)：K2HPO41.0 g、CaCl20.1 g、NaHCO33.0 g、CH3COONa 1.0 g、MgCl20.5 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 1.0 g、微量元素溶液1.0 ml、维生素溶液1.0 ml、琥珀酸钠1.0 g、酵母抽提物0.5 g、蛋白胨0.5 g、琼脂12 g、蒸馏水1 000 ml，pH值6.8。

其中，微量元素溶液：FeCl2·4H2O 1.8 g、CoCl2·6H2O 0.25 g、NiCl2·6H2O 0.01 g、CuCl2·2H2O 0.01 g、MnCl2·4H2O 0.70 g、ZnCl20.1 g、H3BO30.5 g、Na2MoO4·2H2O 0.03 g、Na2SeO3·5H2O 0.01 g、蒸馏水1 000 ml。

维生素溶液：生物素0.1 g、烟酸0.35 g、盐酸硫胺素0.3 g、对氨基苯甲酸0.2 g、盐酸吡多胺0.1 g、泛酸钙0.1 g、维生素B120.05 g、蒸馏水1 000 ml。

基本培养基：K2HPO41.0 g、CaCl20.1 g、NaHCO33.0 g、CH3COONa 1.0 g、MgCl20.5 g、NH4Cl 1.0 g、Na-Cl 1.0 g、微量元素溶液1.0 ml、维生素溶液1.0 ml、琥珀酸钠1.0 g、酵母抽提物0.5 g、蛋白胨0.5 g、蒸馏水1 000 ml，pH值6.8。

双层平板计数培养基：NH4Cl 1.0 g、K2HPO40.2 g、CH3COONa 3.0 g、NaHCO31.0 g、酵母膏 0.2 g、NaCl 1.0 g、MgCl20.20 g、T.M.储液1.5 ml、蒸馏水1 000 ml，pH值6.8。

其中T.M.储液：FeCl35.0 mg、CuSO4·5H2O 0.05 mg、H3BO31.0 mg、MnCl2·5H2O 0.05 mg、ZnSO4·7H2O 1.0 mg、Co(NO3)2·6H2O 0.5 mg、蒸馏水1 000 ml。

双层平板计数培养基中底层平板培养基添加0.8%琼脂，上层平板培养基添加1.0%琼脂。

1.1.3 主要试剂

蛋白胨、酵母膏购自于北京奥博星生物技术有限公司；蔗糖、K2HPO4、NaHCO3、CH3COONa、（NH4）2SO4、NH4Cl、DL-苹果酸、柠檬酸、丁二酸钠、甘油、尿素等主要试剂均为分析纯。

1.1.4 主要仪器

YQX-Ⅱ厌氧培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、T6新世纪紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、PHSJ-3F酸度计（瑞士Mettler Toledo公司）、T8-1磁力搅拌器（金坛市华峰仪器有限公司）、SW-CT-ICU超净工作台（上海博讯实业有限公司）、YP2102电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）、LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、101型电热鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）、DRP-9052型电热恒温培养箱（上海森信试验仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 沼泽红假单胞菌液体菌种的制备

无菌操作条件下提取沼泽红假单胞菌R1菌种2～3环接入装有200 ml液体培养基的250 ml具塞磨口三角瓶中，30℃、40 W白炽灯距离20 cm处照射静置厌氧光照条件下培养14 d，用作沼泽红假单胞菌液体种子备用。

1.2.2 沼泽红假单胞菌R1培养基优化试验

采用单因素试验设计，分别对沼泽红假单胞菌R1进行所需碳源试验。选择7种不同碳源（蔗糖、碳酸氢钠、乙酸钠、DL-苹果酸、柠檬酸、丁二酸钠、甘油）。所需氮源试验，选择5种不同氮源（蛋白胨、酵母膏、氯化铵、尿素、硫酸铵），然后根据发酵培养基碳源、氮源试验的试验结果，选择适宜碳源、适宜氮源、磷酸氢二钾为磷源、微量元素溶液、维生素溶液培养基成分作为5种因素，每个因素设计4个水平，设计正交试验L16（45）。每250 ml具塞磨口三角瓶中装有200 ml液体培养基，灭菌冷却后接入10.0 ml液体菌种，30℃、40 W白炽灯距离20 cm处照射厌氧光照条件下静置培养72 h，分析优化出沼泽红假单胞菌R1较佳的培养基配方。

1.2.3 沼泽红假单胞菌R1培养条件试验

采用单因素试验设计，分别对沼泽红假单胞菌R1优化后的培养基进行接种量试验，按照体积比分别接入发酵培养基（2%、4%、6%、8%、10%）的液体种子；pH值试验，分别调整发酵培养基初始pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；装液量试验，250 ml具塞磨口三角瓶中分别装入液体培养基50、100、150、200 ml，灭菌冷却后接入体积比5%液体菌种；培养温度试验（25、30、35、40 ℃）；光照试验，分别选择不同白炽灯（25、40、60、100 W）距离20 cm处照射培养。接种量试验、pH值试验、培养温度试验、装液量试验、光照试验，每250 ml具塞磨口三角瓶中装有200 ml液体培养基，灭菌冷却后接入体积比5%，即10.0 ml液体菌种，白炽灯距离20 cm处厌氧光照条件下静置培养72 h，分析出沼泽红假单胞菌R1较佳的培养条件。

1.2.4 生长量的测定

发酵培养液经充分振荡摇匀后，采用T6新世纪紫外可见分光光度计，以培养初期刚接入菌种的液体培养基为空白对照，于660 nm处测定发酵培养液OD660值。

沼泽红假单胞菌R1菌数含量的测定采用孙军德等（2001）光合细菌双层平板计数方法进行[9]。

2 结果与分析

2.1 沼泽红假单胞菌R1发酵培养基的筛选

2.1.1 不同碳源试验

ATYP琼脂培养基为基本培养基，氯化铵为供试氮源，磷酸氢二钾为磷源，加入1.0 g/l氯化铵、1.0 g/l磷酸氢二钾、1.0 ml/l微量元素溶液、1.0 ml/l维生素溶液，再分别加入1.0 g/l的蔗糖、碳酸氢钠、乙酸钠、DL-苹果酸、柠檬酸、丁二酸钠、甘油制作培养基，接种沼泽红假单胞菌R1培养7 d后，试验结果见图1。由图1可知，沼泽红假单胞菌R1较适宜的碳源为甘油。

2.1.2 不同氮源试验

以甘油为碳源，磷酸氢二钾为磷源，加入1.0 ml/l微量元素溶液，1.0 ml/l维生素溶液，再分别加入蛋白胨、酵母膏、氯化铵、尿素、硫酸铵为唯一氮源配制培养基,接种沼泽红假单胞菌R1培养7 d后，试验结果见图2。由图2可知，沼泽红假单胞菌R1较适宜的氮源为酵母膏，其次为蛋白胨，但考虑到酵母膏、蛋白胨使生产成本高，营养丰富易造成染菌等因素，因此本试验选择氯化铵为氮源。

图1 不同碳源对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

图2 不同氮源对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

2.1.3 沼泽红假单胞菌R1培养基的优化

以甘油为碳源，氯化铵为氮源，磷酸氢二钾为磷源，添加微量元素溶液、维生素溶液，设计正交试验L16（45），试验设计见表1，其培养基优化试验结果见表2。由表2可知，对沼泽红假单胞菌R1的生长的影响因素为C＞B＞D＞A＞E，因素C磷源磷酸氢二钾为主要影响因素，其它依次为因素B氮源氯化铵、因素D复合微量元素、因素A碳源甘油、因素E复合维生素。其适宜的培养基配方为A2B2C3D1E3，即甘油1.0 g、氯化铵1.0 g、磷酸氢二钾0.3 g、微量元素溶液0.05 ml、维生素溶液0.15 ml、蒸馏水1 000 ml。

2.2 沼泽红假单胞菌R1培养条件的优化

表1 L16（45）正交试验因素水平设计

表2 沼泽红假单胞菌R1正交试验结果

2.2.1 接种量对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

沼泽红假单胞菌R1分别按照体积比的2%、4%、6%、8%、10%接入液体菌种于优化后的培养基200 ml中，于30℃、40 W白炽灯距离20 cm处下静置培养72 h，结果见图3。由图3可知，随着接种量的增加，沼泽红假单胞菌R1菌数OD660值不断增加，当接种量为6%时达到最大值，再加大接种量则OD660值呈现逐步下降趋势，分析原因可能为随着接入沼泽红假单胞菌菌数的增加造成培养基营养的匮乏造成的，其适宜的接种量为6%（V/V）。

图3 不同接种量对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

2.2.2 初始pH值对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

分别调整优化后的培养基初始pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，灭菌冷却后，接入6%的沼泽红假单胞菌R1液体菌种，于30℃、40 W白炽灯距离20 cm处照射静置培养72 h，结果见图4。由图4可知，沼泽红假单胞菌R1较适宜的pH值范围为6.0～8.0，pH值7.0时达到最大值，偏酸、偏碱均不利于其生长。

图4 不同pH值对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

2.2.3 温度对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

将优化后的培养基初始pH值调整为7.0，灭菌冷却后，接入6%的沼泽红假单胞菌R1液体菌种，分别置于培养温度25、30、35、40℃，40 W白炽灯距离20 cm处静置培养72 h，结果见图5。由图5可知，沼泽红假单胞菌R1在设置的温度下均能生长，较适宜的培养温度为30～35℃，30℃时达到最大值，40℃时菌数OD660值下降较多。

2.2.4 光照强度对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

将优化后的培养基初始调整为pH值7.0，灭菌冷却后，接入6%的沼泽红假单胞菌R1液体菌种，30℃，分别置于25、40、60、100 W白炽灯下距离20 cm处照射静置培养72 h，结果见图6。由图6可知，较适宜的为40 W白炽灯下照射，随着白炽灯功率W的增大，菌数OD660值明显下降，分析原因可能为沼泽红假单胞菌R1不需要较强的光照强度。

图5 不同温度对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

图6 不同光照强度对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

2.2.5 装液量对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

初始pH值7.0，具塞磨口250 ml三角瓶中分别装入优化后液体培养基50、100、150、200 ml，灭菌冷却后，接入6%的沼泽红假单胞菌R1液体菌种，30℃、置于40 W白炽灯下距离20 cm处照射静置培养72 h，结果见图7。由图7可知，250 ml三角瓶中装入50 ml液体培养基中测定的菌数OD660值最大，随着装液量的增加，菌数OD660值呈下降趋势。分析原因可能为在少量氧气存在的情况下，沼泽红假单胞菌R1生长更好一些，少量氧气可以促进沼泽红假单胞菌R1的生长。

图7 不同装液量对沼泽红假单胞菌R1生长的影响

2.2.6 最佳培养条件的确定

优化后的液体培养基调整初始pH值7.0，250 ml三角瓶中装入50 ml培养基，接种量为6%（V/V），30℃、置于40 W白炽灯下距离20 cm处照射静置培养7 d，沼泽红假单胞菌R1菌数OD660值可达2.066，经双层平板计数法检测沼泽红假单胞菌R1菌数可达5.6×108个/ml。

3 结论

①根据生产实际需要，经优化后沼泽红假单胞菌R1其适宜的培养基配方为：甘油1.0 g、氯化铵1.0 g、磷酸氢二钾0.3 g、微量元素溶液0.05 ml、维生素溶液0.15 ml、蒸馏水1 000 ml。

②经优化后沼泽红假单胞菌R1其适宜的培养条件为：初始pH值7.0、培养温度30℃、接种量为6%、装液量为液体培养基50 ml/250 ml三角瓶、40 W白炽灯下距离20 cm处照射静置培养。

③采取以上适宜的培养基、培养条件下进行培养，沼泽红假单胞菌R1菌数OD660值可达2.066，经双层平板计数法检测沼泽红假单胞菌R1菌数可达5.6×108个/ml。