17β-雌二醇及其受体调节剂对去卵巢大鼠子宫钙黏蛋白和连环蛋白表达的影响*

都中蕊，李红芳，△，张 伟，田治峰，邱小青，卢研宇，梁乾坤，汪龙德

（1.兰州大学基础医学院生理学教研室，2.兰州大学基础医学院机能实验室，3.甘肃中医学院附属医院，兰州730000）

针对治疗绝经期综合征的雌激素替代疗法目前存在许多争议，不当使用雌激素可能导致宫颈癌、乳腺癌、子宫内膜癌等疾病的发病率增加［1-3］，对雌激素的研究和应用还有待于进一步深入。研究发现，雌激素可改变黏附连接分子复合体的结构，进而影响细胞间的黏附以及血管通透性［4］。在该复合体结构中，钙黏蛋白（E-cadherin）、α-连环蛋白（α-catenin）、β-连环蛋白（β-catenin）是三种重要的黏附连接蛋白，通过其相互作用使相邻细胞紧密连接在一起［5］。体内雌激素异常而诱发雌激素依赖性肿瘤的发病机制可能与上述黏附连接复合体有关，但目前对雌激素引起钙黏蛋白和连环蛋白表达变化的机制尚未完全阐明，因此本实验主要目的是研究Est对子宫钙黏蛋白和连环蛋白表达的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

17β-雌二醇、他莫昔芬均购自 Sigma公司，α-catenin、βcatenin及内参β-actin的单克隆抗体均购自Santa Cruz公司，E-cadherin单克隆抗体购自博奥森公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2 动物分组

选用12周左右健康雌性SD大鼠42只，体重200～230 g，随机分为7组（n＝6）。麻醉后摘除双侧卵巢。实验分组设计为：假手术组（Sham）；卵巢切除组（Ovx）；17β-雌二醇低、中、高剂量组 （Ovx＋Est）：Est剂量分别为 0.01 mg／kg、0.1 mg／kg、1.0 mg／kg；17β-雌二醇中、高剂量 ＋他莫昔芬组（Ovx＋Est＋Tam）；Est剂量分别为 0.1 mg／kg、1.0 mg／kg，Tam剂量为

30 .0 mg／kg；隔日皮下注射给药，21 d后麻醉取子宫组织。

1.3 免疫组化SP法

将子宫组织石蜡切片脱蜡至水、抗原修复后，按照免疫组化SP试剂盒的说明进行实验。免疫组化实验共设8组，除上述7组外增加一组阴性对照组（即用 PBS替代一抗孵育），结果判断：以细胞质和（或）细胞核内出现淡黄色至棕黄色颗粒作为阳性细胞，每例标本选取5个高倍镜视野进行阳性细胞计数：阳性细胞百分比小于5%为0分，5%～15%为1分，16%～30%为2分，31%～50%为3分，大于50%为4分。同时按着色强度计分：（1）0分：无染色，呈阴性；（2）1分：染色弱，呈淡黄色；（3）2分：染色中等，呈黄色；（4）3分：染色强，呈棕黄色。两者积分乘积的高低决定阳性与否：0分为阴性（-）；1～4分为弱阳性（＋）；5～8分为中度阳性（＋＋）；9～12分为强阳性（＋＋＋）。

1.4 Western blot法

提取子宫组织总蛋白，进行Western blot法检测，经过制胶、电泳、转膜后，进行封闭，再经过一抗、二抗孵育，最后进行曝光显影定影。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 17β-雌二醇对钙黏蛋白、连环蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，α-catenin、β-catenin和 E-cadherin三种蛋白在各实验组中均有表达，主要定位于子宫内膜上皮细胞和腺泡上皮细胞的细胞膜和胞浆，β-catenin还有少量表达于细胞核。Sham组上述三种蛋白表达较低；Ovx组子宫萎缩明显，三种蛋白的表达较Sham组显著上调；与Ovx组相比，三种蛋白在Est中、高剂量组的表达均下调，Est低剂量组的表达与Ovx组无显著差异（图1，表1，图1见彩图页Ⅲ）。

Western Blot法检测α-catenin的表达与免疫组化结果一致（图 2）。各组相对灰度值：Sham组0.15±0.008，Ovx组0.74±0.024，Ovx＋Est组 0.80±0.036，Ovx＋Est组 0.2±0.019，Ovx＋Est组 0.31±0.005（图 2）。

2.2 选择性雌激素受体调节剂对雌二醇引起的钙黏蛋白、连环蛋白表达下调的影响

免疫组化结果显示，他莫昔芬对 Est（0.1 mg／kg）引起的α-catenin、β-catenin和 E-cadherin表达下调具有拮抗作用；而对Est（1.0mg／kg）引起的上述三种蛋白表达下调则表现出部分协同作用（图1，表1，图1见彩图页Ⅲ）。

Tab.1 Statistical analysis of the immunohistochemical staining results ofα-catenin andβ-catenin and E-cadherin in the uterus of rats in different groups（，n＝6）

Tab.1 Statistical analysis of the immunohistochemical staining results ofα-catenin andβ-catenin and E-cadherin in the uterus of rats in different groups（，n＝6）

Ovx：Ovariesctomy；Est：Estradiol；Tam：Tamoxifen**P＜0.01 vs sham group；＃＃P＜0.01 vs Ovx group

Group α-catenin β-catenin E-cadherin Sham 1.333±0.516 3.000±0.632 2.667±0.516 Ovx 10.000±1.549**11.333±1.633**12.000±0**Ovx＋Est 0.01 9.000±1.897**10.667±2.066**9.833±2.563**Ovx＋Est 0.1 1.500±0.548＃＃ 3.167±0.753＃＃ 2.000±0.894＃＃Ovx＋Est 1.0 6.000±1.265＃＃ 6.333±0.816＃＃ 6.333±2.251＃＃Ovx＋Est 0.1＋Tam 10.668±2.066**11.333±1.633**11.500±1.225**Ovx＋Est1.0＋Tam 2.000±0＃＃ 3.333±0.516＃＃ 2.500±0.548＃＃

Fig.2 Results of Western blot ofα-catenin andβ-actin proteins（A）and relative expression level ofα-catenin（B）in uterine tissue of ovariectomized rats

3 讨论

钙黏蛋白和连环蛋白在维持血管通透性方面有重要作用［6］，血管通透性由穿细胞途径和与黏附连接蛋白有关的细胞旁途径所决定［7］。本实验从Est影响细胞旁途径的角度进行研究发现，钙黏蛋白和连环蛋白在Est中剂量组和假手术组子宫组织中的表达无显著差异，且均表达较低，切除卵巢引起的内源性雌激素缺乏会使其表达显著增高，Est的干预可使去卵巢大鼠子宫钙黏蛋白和连环蛋白的表达下调，但无剂量效应，推测其原因可能是由于血管通透性不仅与黏附连接分子的表达量有关，还与黏附连接复合体结构的改变有关，复合体结构中钙黏蛋白、连环蛋白和细胞骨架的分离，会破坏内皮细胞间的黏附联接，引起血管通透性增加。此外，钙黏蛋白和连环蛋白介导细胞粘附，与肿瘤发生发展密不可分，细胞间粘附力的下降有利于肿瘤的转移。有研究发现βcatenin还参与Wnt信号转导通路，Est可激活该通路使细胞膜上β-catenin与E-cadherin分离，破坏细胞黏附连接，同时，游离在胞浆中的β-catenin进入细胞核，激活癌基因，导致肿瘤发生［8］。

他莫昔芬是一种选择性雌激素受体调节剂，具有双向调节作用，可与雌激素竞争性结合雌激素受体而产生抗雌激素效应，或激活雌激素受体而产生雌激素样作用。我们推测，Tam可干预Est引起的钙黏蛋白、连环蛋白表达下调作用，故Est对钙黏连蛋白和连环蛋白表达的影响机制可能与雌激素受体有关，Se-Hyung Park等［9］的研究也支持了这一结论。

通过研究Est对大鼠子宫钙黏蛋白、连环蛋白表达的影响，发现其作用机制与雌激素受体有关，有助于探索雌激素影响血管通透性和细胞黏附的机制，以及雌激素依赖性肿瘤的发病机制，为临床肿瘤的防治提供依据，有利于人们找到新的肿瘤治疗方法，同时也为他莫昔芬在雌激素替代疗法中的运用提供依据，但由于雌激素在体内的作用十分复杂，其机制还有待于深入研究。

［1］ Carico E，Atlante M，Bucci B，et al.E-cadherin andαcatenin expression during tumor progression of cervical carcinoma［J］.Gynecol Oncol，2001，80（2）：156-161.

［2］ Schairer C，Lubin J，Troisi R，et al.Menopausal estrogen and estrogen-progestin replacement therapy and breast cancer risk［J］.JAMA，2000，283（4）：485-491.

［3］ Rubin GL，Peterson HB，Lee NC，et al.Estrogen replacement therapy and the risk of endometrial cancer：Remaining controversies［J］.Am JObstet Gynecol，1990，162（1）：148-154.

［4］ Groten T，Pierce AA，Huen AC，et al.17β-estradiol transiently disrupts adherens junctions in endothelial cells［J］.FASEB J，2005，19（10）：1368-1370.

［5］ Ingber DE.Cell structure and hierarchical systems biology［J］.J Cell Sci，2003，116（Pt 7）：1157-1173.

［6］ 赵克森，黄巧冰.血管通透性增高的基本机制［J］.中国病理生理杂志，2003，19（4）：549-553.

［7］ Komarova Y，Malik AB.Regulation of endothelial permeability via paracellular and transcellular transport pathways［J］.Annu Rev Physiol，2010，72（3）：463-493.

［8］ Medrdk C，Landberg G，Andersson T，et al.WNT-5a-CKI α-signaling promotesβ-catenin／E-cadherin complex formation and intercellar adhesion in human breast epithelial cells［J］.Biol Chem，2009，284（16）：10968-10979.

［9］ Park SH，Cheurg LW，Wong AS，et al.Estrogen regulates Snail and Slug in the down-regulation of E-Cadherin and induces metastatic potential of ovarian cancer cells through estrogen receptor alpha［J］.Mol Endocrinol，2008，22（9）：2085-2098.