慢性吗啡依赖大鼠条件性位置厌恶过程杏仁核中央核Kappa阿片受体表达变化*

宋秀花，吕江玲，李文强，张景丹，石玉中，张瑞岭，李 毅

（1.青岛市精神卫生中心，山东 青岛266034；2.新乡医学院第二附属医院，河南 新乡453002；3.武汉市精神卫生中心，湖北武汉，430022）

阿片成瘾是精神活性物质滥用中犒赏-渴求通路介导的一种强迫性行为，同样也是阿片物质滥用强大有力的享乐原则的反应。一旦某种物质成瘾则标志着复杂神经适应性机制的形成，导致了药物耐受、渴求及复吸直至药物滥用等［1］，造成了严重的社会和生物医学问题。Kappa阿片受体系统被用来研究应激诱导行为及成瘾行为［2］，并证实Kappa阿片受体活性与厌恶有关，负性调节奖赏行为。本实验主要是通过测定CPA建立前后KOR蛋白表达水平来观察阿片成瘾戒断后厌恶动机形成的生物学基础，为打破毒品的负性强化循环寻找可能的干预靶点。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

盐酸吗啡注射液（morphine hydrochloride injection，东北制药集团公司沈阳第一制药厂生产，批号为100305-1）盐酸纳洛酮注射液（naloxone hydrochloride injection，北京四环制药有限公司生产，批号为20100207），兔抗大鼠 Kappa多克隆抗体（IMGENEX，批号IMG-71465），山羊抗兔二抗（北京中杉公司，批号 SP9001）。

1.2 动物及分组

选用72只SPF雄性SD大鼠，随机分为3组。慢性吗啡注射＋纳洛酮催瘾组（morphine＋naloxone，MN），简称 MN组；慢性吗啡注射＋生理盐水“催瘾”组（morphine＋saline，MS）和慢性生理盐水注射＋纳洛酮催瘾组（saline＋naloxone，SN），分别简称MS和SN组。

1.3 慢性吗啡注射

从第 1天（Day1）至第 7天（Day7），每天两次（8AM；8PM），每次每千克体重为10 mg，腹腔注射（IP），共计注射6.5 d。

1.4 慢性吗啡依赖纳洛酮催瘾戒断CPA的建立

CPA建立基本上可以分为三个阶段：条件化前期（preconditioning session）、条件化期（conditioning session）以及条件化后CPA测试期（test session）条件化前的适应：在Day4，8AM的吗啡或生理盐水注射之后的2 h（10Am），将实验鼠逐个放入训练箱，让其自由摸索黑侧和白侧，共计15 min（900 s），以适应训练箱，并自动记录试验鼠在黑侧和白侧的时间。

条件化前期（Day5）：与Day4的处理一样，并同时记录试验鼠在黑侧和白侧的时间。偏好侧的评定：Day5，实验鼠在一侧的时间大于总时间的一半（450 s）。

条件化搭配期：Day6，在8AM的吗啡／生理盐水注射后2 h（10 AM），腹腔注射生理盐水（1 ml／kg体重）后，把实验鼠限制在非偏好侧30 min。4 h后（2PM），MN组和SN组腹腔注射纳洛酮（0.3 mg／kg体重），MS组注射等体积的生理盐水后，将实验鼠限制在偏好侧30 min。

CPA测评期：在Day7，在8AM的吗啡／生理盐水注射后2 h（10AM），让实验鼠在训练箱里自由摸索15 min，并自动记录试验鼠在两侧内的时间。具体方法参考文献［3，4］。

1.5 免疫组化标本的制备

具体方法参考文献［5］。

1.6 免疫组化结果的观察与图像分析（KOR蛋白表达测定）

每组选取免疫组织化染色切片各4张，4张图片分别来自不同的动物，使用Motic病理图像分析系统测量阳性神经元的平均灰度值。

1.7 统计处理

2 结果

2.1 三组大鼠CPA评定的结果

CPA条件化后，MN组实验鼠在伴药侧的时间（s）较条件化前期明显减少，差异有显著性（P＜0.01），MN组大鼠形成了明显的CPA，MS组和SN组在伴药侧的时间结果显示两者之间的差异无统计学意义（表1）。

Tab.1 Aversion scores and time in naloxone-paired compartment at preconditioning session and test session（s，，n＝24）

Tab.1 Aversion scores and time in naloxone-paired compartment at preconditioning session and test session（s，，n＝24）

MN：Morphine＋naloxone；MS：Morphine＋saline；SN：Saline＋naloxone**P＜0.01 vs preconditioning session

Group Preconditioning session Test session Aversion scores MN 608.60±50.70 445.67±42.40**-179.83±38.92 MS 578.60±87.95 526.66±63.02-55.13±88.92 SN 553.63±86.94 550.69±78.11-19.99±37.79

2.2 大鼠杏仁核中央核KOR的表达水平

CPA建立前，MN组KOR的表达水平较对照组MS组和SN组差异无显著性。CPA建立后MN组KOR蛋白表达水平升高（限于 SN组），差异有显著性（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Kappa opioid receptor expression in the CeA at preconditioning session and test session（，n＝24）

Tab.2 Kappa opioid receptor expression in the CeA at preconditioning session and test session（，n＝24）

MN：Morphine＋naloxone；MS：Morphine＋saline；SN：Saline＋naloxone**P＜0.01 vs MSand SN

Group Preconditioning session Test session MN 132.89±10.35 99.56±7.67**MS 109.83±7.30 85.43±7.81 SN 121.00±2.73 118.25±1.71

3 讨论

阿片受体主要的药理学作用是作为止痛剂，它的副反应包括药物耐受和成瘾［6］。与犒赏效应、情绪状态和认知功能的调整有关。杏仁核尤其是CeA主要调节应激引起的生理学反应以及中枢神经系统多巴胺水平的变化［7］。

本研究发现，CPA是在强啡肽／Kappa阿片受体系统在反复刺激或激动剂作用下产生的［8］。CPA建立后MN组大鼠Kappa阿片受体在CeA内明显高表达，大量研究证明Kappa阿片受体在可卡因成瘾、自我给药及其戒断发挥着重要作用，Piras等人应用慢性可卡因注射将大鼠分成可卡因组和生理盐水组来观察给药后24 h和14 d各个脑区Kappa阿片受体的表达变化发现，可卡因戒断后CeA内Kappa阿片受体的表达水平增加，与本实验结果一致，并认为Kappa阿片受体可能对可卡因急性戒断起着重要作用［9］。

CPA模型建立后MN组大鼠出现明显的戒断症状，如湿狗样抖动，躯体拉伸，直立，跳跃，腹泻等可能与Kappa阿片受体调节应激引起的焦虑样行为和厌恶行为有关［10］。许多的研究提示Kappa阿片受体可能调节学习和记忆行为，连续6.5 d吗啡注射后给予Kappa阿片受体拮抗剂纳洛酮可能是加强了大鼠对其环境的厌恶记忆过程［11］，或是提高了奖赏阈值［12］，戒断令其极其厌恶。为了摆脱这种负面情绪促使其对成瘾物质的渴求最后导致复吸。

CPA大鼠，应用纳洛酮催瘾戒断后药物渴求行为立即达到一定高度，这种改变是持久性的，失去了对过量药物摄入的控制力。与对照组相比它们最大的不同是调整药物摄取作为外界临时变化的能力。对于大多数个体来说，大脑会随时调整自己的行为，恢复其正常的可塑性，并学会控制药物摄取。而成瘾者久而久之药物刺激形成一种恶性循环，对药物摄取不再节制，不能控制自己的行为最后导致强迫性复吸［13］。

药物诱导KOR活性的增加与戒断相关的负性情绪状态相一致，通过拮抗戒断症状减少药物依赖戒断的核心症状——复吸。因此，KOR拮抗剂可能对治疗药物依赖是有利的。当物质依赖达到一定程度，通过抑制KOR来减少强迫性复吸可能是有效的。因此抑制KOR活性可能是阻断强迫性复吸的重要靶点［14］。

［1］ Koob GF，Le Moal M.Addiction and the brain antireward system［J］.Annu Rev Psychol，2008，59：29-53.

［2］ Bruchas MR，Land BB，Chavkin C.The dynorphin／kappa opioid system as a modulator of stress-induced and pro-addictive behaviors［J］.Brain Res，2010，1314：44-55.

［3］ Li Y，Liu X，Chen H，et al.Development，extinction and reinstatement of morphine withdrawal-induced conditioned place aversion in rats［J］.Addict Biol，2007，12（3-4）：470-477.

［4］ 张登科，张宏卫，石富娟，等.吗啡戒断对糖水条件性位置偏爱建立的影响［J］.中华行为医学与脑科学杂志，2010，19：116-117.

［5］ 宋秀花，李文强，冯玉芳，等.慢性吗啡依赖大鼠条件性位置厌恶模型杏仁中央核蛋白激酶A表达变化［J］.中国应用生理学杂志，2012，28（2）：255-257.

［6］ Lobmaier P，Gossop M，Waal H，et al.The pharmacological treatment of opioid addiction--a clinical perspective［J］.Eur J Clin Pharmacol，2010，66（6）：537-545.

［7］ Naylor JC，Li Q，Kang-Park MH，et al.Dopamine attenuates evoked inhibitory synaptic currents in central amygdala neurons［J］.Eur J Neurosci，2010，32（11）：1836-1842.

［8］ Land BB，Bruchas MR，Schattauer S，et al.Activation of the kappa opioid receptor in the d orsal raphe nucleus mediates the aversive effects of stress and reinstates drug seeking［J］.PNAS，2009，106（45）：19168-19173.

［9］ Piras AP，Zhou Y，Schlussman SD，et al.Acute withdrawal from chronic escalating-dose binge cocaine administration alters kappa opioid receptor stimulation of［35S］guanosine 5’-O-［gamma-thio］triphosphate acid binding in the rat ventral tegmental area［J］.Neuroscience，2010，169（2）：751-757.

［10］Bruchas MR，Land BB，Lemos JC，et al.CRF1-Ractivation of the dynorphin／Kappa opioid systemin the mouse basolateral amygdala mediates anxiety-like behavior［J］.PLoSONE，2009，4（12）：e8528.

［11］Carey AN，Lyons AM，Shay CF，et al.Endogenousκopioid activation mediates stress-induced deficits in learning and memory［J］.J Neurosci，2009，29（13）：4293-4300.

［12］Schindler AG，Li S，Chavkin C，et al.Behavioral stressmay increase the rewarding valence of cocaine-associated cues through adynorphin／kappa-opioid receptor-mediated mechanism without affecting associative learning or memory retrieval mechanisms［J］.Neuropsychopharmacology，2010，35（9）：1932-1942.

［13］Kasanetz F，Deroche-Gamonet V，Berson N，et al.Transition to addiction is associated with a persistent impairment in synaptic plasticity［J］.Science，2010，328（5986）：1709-1712.

［14］Wee S，Koob GF.The role of the dynorphinκopioid system in the reinforcing effects of drugs of abuse［J］.Psychopharmacology，2010，210（2）：121-135.