蛋白质组学在肺癌研究中的应用

王 攀 李招云

（台州市恩泽医疗（集团）中心医院，浙江台州 318000）

·综述·

蛋白质组学在肺癌研究中的应用

王 攀 李招云

（台州市恩泽医疗（集团）中心医院，浙江台州 318000）

蛋白质组学是指对机体、组织或细胞的全部蛋白质的表达和功能模式的研究。目前用于蛋白质研究的支撑手段主要有双向凝胶电泳和质谱分析技术等。肺癌是当前全球癌症发病率最高的恶性肿瘤之一。通过对正常肺和肺癌的组织或血清或细胞的蛋白质组研究，可以直接比较两者之间蛋白质组表达的差异，为肺癌的早期诊断、疗效观察及预后评价等提供指导。

蛋白质组学；肺癌；质谱技术

20世纪90年代新生了一门以蛋白质组为研究对象，在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的一门新兴学科——蛋白质组学。蛋白质组学（Proteomics）是作为功能基因组学的重要支柱，并已同基因组学（Genomics）和生物信息学（Bioinformatics）一起成为新世纪生命科学研究的前沿和热门领域［1］。

原发性支气管肺癌（Primary bronchogenic carcinoma）简称肺癌（Lung cancer），肺肿瘤细胞源于支气管黏膜或腺体，常有区域性淋巴细胞结转移和血性播散，早期常有刺激性咳嗽、痰中带血等呼吸道症状。癌症的发生是机体正常细胞在多因素、多基因作用下经过多途径发生转化，不论是环境因素还是遗传因素，最终都必须通过基因及相应蛋白质的表达来发挥作用。蛋白质的丰度、结构或功能的改变不仅在患者出现临床症状之前就已经给出了重要的病理学异常的暗示，而且还是重要的诊断性和先兆性生物学标志［2］。所以直接从蛋白质整体水平入手，分离和鉴定正常人与肺癌患者肺组织或血清或细胞中表达的蛋白质、分析蛋白质表达谱的差异，对研究肺癌发病机制、早期诊断、治疗及预后具有重要意义。

1 蛋白质组学的概念和研究内容

蛋白质组学的概念是由澳大利亚Macquarie大学的Williams和Wilkins等［3］于1994年首次提出，广义上指的是一个给定的细胞、组织、器官或完整的生物体拥有的全部蛋白质，是一个基因组内所有基因表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，以全面的蛋白质性质为研究基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式及功能联系等方面进行探索的一门新兴学科［4］。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白质亚型在某种生理或病理状态中发生的相应变化。

2 蛋白质组学的相关技术

蛋白质组学研究的首要任务是建立获取和分析蛋白质的常规、可靠、有效的技术平台。现阶段蛋白质组的研究可分为3个主要步骤：（1）应用双向凝胶电泳、“双向”高效柱层析分离蛋白质；（2）应用氨基酸组成分析、C－或N－末端氨基酸序列分析及质谱分析鉴定所分离的蛋白质；（3）应用生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析。

3 蛋白组学在肺癌中的应用

3.1 肺癌发生发展机制 沙慧芳等［5］应用DIGE和质谱技术对肺癌患者和肺部炎症患者、健康者之间血浆蛋白质表达谱的差异进行研究。实验结果共找到72个差异蛋白点，27个蛋白质点被成功鉴定，其中7种已知与肿瘤密切相关：参与脂肪酸代谢途径的ACSF3和可促进肺癌细胞生长的α和β－纤维蛋白在肺癌中上调；补体因子H和血清淀粉样蛋白中的急性相蛋白A过表达；GPⅠb特异性抗体在肺癌中升高，估计与肺癌患者免疫系统被激活而使机体产生针对血小板膜糖蛋白自身抗原的特异性抗体有关。Pernemalm等［6］采用质谱技术分析推测预后较差的肺腺癌患者有较高的糖酵解活性和HIF激活，以及在早期复发的肺腺癌患者中检测出HIF1αmRNA过表达，认为在预后不良组的上调蛋白质（组织蛋白酶D，ENO1和VDAC1）确实起源于肿瘤而非基质或炎症的部位，为进一步深入理解肿瘤发展机制提供了依据。

3.2 肺癌肿瘤标志物的筛选 改善肺癌患者预后的关键在于早期发现、早期诊断，而肺癌的早期诊断率仅15%～25%［7］。同时，研究发现肺癌患者诊断的中位医生延迟时间为1.3周（0.3～52.3周），29.1%的患者首次诊断时被误诊［8］。目前临床上使用最多的肿瘤标志物为癌胚抗原和鳞状上皮细胞癌抗原，但是灵敏性和特异性均不够，因此有必要发现更具有针对性的肺癌标志物。刘丹等［9］运用MALDI－TOF－MS磁珠技术对正常人与肺腺癌患者的血清进行比较，发现6个差异蛋白峰，其中m／z为2661、2991的差异蛋白峰在肺腺癌组表达升高，m／z为4091、4210、4644、5336的差异蛋白峰在肺腺癌组表达降低。提示6个差异蛋白峰可能是肺腺癌患者潜在的肿瘤标志物。Lee等［10］采用2－DE和肽质量指纹图谱技术研究肺癌组织及邻近正常组织的蛋白表达发现几种差异表达蛋白，这些差异蛋白在肺癌组织中表达活性增强，如GRP78、GRP96、HSP27、GST、L－岩藻糖、β－肌动蛋白、微管蛋白β－2／3、膜联蛋白A5／3、14－3－3θ等。Lee认为这些改变可以用于支持肺癌诊断的标志物。Jeong等［11］采用2－DE和MALDITOF技术分析小细胞肺癌组织和正常支气管上皮细胞之间的差异蛋白，发现7种蛋白（Y－肌动蛋白、α－ 1B微管蛋白、COTL－1、层粘连蛋白B1、泛素羧基末端酯酶L1、泛素结合酶E2－25以及碳酸酐酶1）在小细胞肺癌（SCLC）中表达上调2倍以上，特别是COTL－1可以看作是SCLC的肿瘤标记物和治疗目标。Shevchenko等［12］对77例肺鳞癌和10例健康人血浆标本用液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）进行分析研究，发现43种蛋白质在肺腺癌中过度表达，其中某些蛋白质高表达参与了肿瘤的进展和转移，被认为可以用于支持肺癌诊断的标志物。Chaudhary等［13］对肺癌患者和健康人肺组织采用液相色谱－质谱（LC－MS／MS）进行分析，结果显示66种蛋白在癌组织中的过表达，经鉴定得出三种蛋白，即过氧化物氧化还原酶－6，β－肌动蛋白和胶原蛋白α－1（VI）可以作为肺癌的早期诊断的潜在标志物。

3.3 辅助病理学分型 Chen等［14］对93例肺腺癌和10例正常肺组织标本用2－DE－PAGE和MALDITOF－MS技术进行研究，发现9种蛋白质在肺腺癌中过度表达，其中某些蛋白质高表达与特定的临床病理变化密切相关。Yanagisawa等［15］采用MALDITOF－MS技术对79例肺癌、14例正常肺组织冰冻切片进行实验，研究非小细胞肺癌的组织学分类、淋巴结转移及预后的蛋白质谱。实验结果共识辨出1600个蛋白峰，并建立了一种用蛋白质差异指纹网谱进行肺癌组织学分类的模型。使用该模型对42例肺癌和8例正常肺组织的样本进行准确的组织学分类，区分原发肿瘤和转移瘤，对淋巴结受累区分的准确率达85%，利用这一模型在37例肺癌、6例正常肺组织的盲筛中也得到较高的准确率。

3.4 疗效预测 手术根治仍是目前治疗肺腺癌唯一有确切疗效的方法，术后配合化疗，其5年生存率可达15%～40%。随着人们对联合化疗分子机制认识的不断进展，发现一些肿瘤分子标志物的改变与化疗敏感性有关，并且在肺癌预后方面也具有绝对的优势。Li等［16］用R－MVL作用于肺癌细胞A549后，采用质谱技术分析差异蛋白，确定其中7种与A549凋亡相关蛋白，包括2种上调蛋白：β－肌动蛋白和醛脱氢酶1，以及5种下调蛋白：丝束蛋白3、原肌球蛋白3、热休克蛋白90、热休克蛋白30和β－微管蛋白。该研究成果为治疗肺癌提供了潜在的靶点，同时促进抗癌治疗策略的发展。Zeng等［17］通过2－DE与MALDITOF相结合，比较肺腺癌A549细胞和顺铂耐药A549／DDP细胞之间蛋白质的差异。结果显示DJ－1的高表达与患者预后不良密切相关，提示DJ－1可以作为预测以顺铂为基础化疗患者的预后。Zhang等［18］采用iTRAQ标记结合2D LC－MS／MS分析原发性肺腺癌和癌旁正常肺组织差异蛋白质的表达，结果显示，脂阀结构蛋白－1的水平可以预测是肺腺癌的淋巴结转移和预后的状况。

3.5 肺癌蛋白质表达数据库的完善 目前还没有完全阐述已分离的差异蛋白的作用，但为今后进一步深入研究打下了基础。美国密歇根大学医学中心在NIH资助下应用蛋白组学方法对包括肺癌在内的癌细胞和组织进行了大规模的研究，并着手建立肺癌蛋白表达数据库［19］。

4 肺癌蛋白组学发展前景

随着肺癌发病率的不断上升，蛋白质组学技术在肺癌中的应用成为国内外研究的热点之一，并且在发病机制、标记物选择、疗效预测等方面取得了一些成果。但目前技术中还存在许多问题，如：研究样品用量大、重复性差、研究样品中含有的多种成分对图谱准确度分析产生干扰、蛋白质分离技术难以满足蛋白质种类分离的要求以及难以实现自动化等，并且在研究中发现的肿瘤差异蛋白也缺乏临床证据，不能完全应用于临床。相信随着科学技术的不断进步，蛋白组学必将在肺癌的临床应用中发挥越来越重要的作用。

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［3］ Wilkins M R，Sanchez J C，Cooley A A，et a1．Progress with proteome projects：why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it．Biotechnol Genet Eng Rev，1996，13：19

［4］ James P．Protein identification in the post－genome era：the rapid rise of proteomics．Q Rev Biophys，1997，30（4）：279

［5］ 沙慧芳，孙强玲，杨晓华，等．应用差异凝胶电泳及质谱技术筛选肺癌患者血浆差异蛋白．上海交通大学学报（医学版），2010，30（4）：399

［6］ Pernemalm M，De Petris L，Branca R M，et al．Quantitative proteomics profiling of primary lung adenocarcinoma tumors reveals functional perturbations in tumor metabolism．J Proteome Res，2013，12（9）：3934

［7］ 孟嘉，李俊，陈振东．肺癌早期诊断研究进展．现代肿瘤医学，2009，17（7）：1381

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［9］ 刘丹，刘伦旭，袁泉，等．运用激光解析电离飞行时间质谱技术检测肺腺癌的血清蛋白表达．四川大学学报（医学版），2010，41（3）：498

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［18］ Zhang P F，Zeng G Q，Hu R，et al．Identification of flotillin－1 as a novel biomarker for lymph node metastasis and prognosis of lung adenocarcinoma by quantitative plasma membrane proteome analysis．J Proteomics，2012，77：202

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浙江省中医药科技计划项目（2011ZA114）