基于代谢组学的脓毒症实验研究进展

马军宏，侯艳婷，杨秀竹，于向阳，周振理

综述

基于代谢组学的脓毒症实验研究进展

马军宏1,2，侯艳婷1,3，杨秀竹2，于向阳2，周振理2

脓毒症是危重病医学面临的棘手难题，也是危重病人死亡的主要原因。临床检测具有一定的滞后性，利用代谢组学对脓毒症患者进行早期预测，及时治疗以减少其死亡率具有重要意义。

脓毒症；代谢组学；生物标记物

脓毒症是由感染引起的全身性炎症反应，同时也是创伤、烧伤、休克、感染、大手术等临床急危重患者的严重并发症之一。全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，并且以每年1.5%～8.0%的速度上升[1]。代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新发展起来的一门组学技术，以一组代谢物群体作为“模式标志物”来诊断疾病，可实现脓毒症的早期诊断和诱因的早期鉴别，并采取有效的针对性治疗，有望改善脓毒症的预后，降低脓毒症的病死率和医疗费用。为了更好地了解脓毒症代谢组学研究，我们对代谢组学概念、脓毒症发病机制及代谢组学实验流程与应用进行概述。

1 代谢组学的概念和特点

代谢组学(metabonomics)的概念来源于代谢组。代谢组是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物，代谢组学则是对这些物质在一特定生理时期内进行定性和定量分析的一门学科，是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新发展起来的一门组学技术，是系统生物学的重要组成部分。它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支。

根据研究对象和目的的不同，代谢组学可分为4个层次上的研究[2]：⑴代谢物靶标分析，即某个或某几个特定代谢组分的分析；⑵代谢轮廓分析，是对少数预设的一些代谢产物的定量分析，如某一类结构、性质相关的化合物或某一代谢途径的所有中间产物或多条代谢途径的标志性组分的定量分析；⑶狭义代谢组学，是在限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量；⑷代谢物指纹分析，即不分离鉴定具体的单一组分，而是对样品进行快速分类(如表型的快速鉴定)。

代谢组学改变了单一标志物检验的传统思路，以一组代谢物群体作为“模式标志物”来诊断疾病。与其他组学相比，代谢组学有许多独特的优势[3-4]：⑴代谢物是病理生理改变的最终结果，它调控着许多细胞内的生命活动(如细胞信号传导、能量传递等)，能更准确地反映生物体系的状态；⑵基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物上得到放大，检测更容易；⑶不需要建立全基因组测序及大量表达序列标签(EST)的数据库，代谢组学技术也更通用，目前网络资源的数据库不下百种，例如KEGG、BioCyc包含EcoCyc和Metacyc Human Metabolome Datebase、PathDB、UM-BBD、BRENDA；⑷代谢物种类在103左右，且在各个生物体系中相类似。故问世以来，代谢组学已广泛用于疾病诊断、药物开发、营养科学、植物代谢组学和微生物代谢组学等领域，并取得较大的成就。

2 脓毒症发病机制的研究

脓毒症的发病可能与以下几种情况有关[5]：⑴细菌内毒素：脓毒症病理生理过程中出现失控的炎性反应、免疫功能紊乱、高代谢状态及多器官功能损害，均可由内毒素直接或间接触发。⑵炎症介质：脓毒症中感染因素激活机体单核巨噬细胞系统及其他炎症反应细胞，产生并释放大量炎性介质所致。某些细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)-α等可能在脓毒症的发生、发展中起到重要作用。⑶免疫功能紊乱：一方面是作为免疫系统的重要调节细胞T细胞功能失调，炎症介质向抗炎反应漂移，致炎因子减少，抗炎因子增多；另一方面则表现为免疫麻痹。⑷肠道细菌/内毒素移位：应激发生时导致的机体最大的细菌及内毒素储存库-肠道发生功能失调，进而引起的肠道细菌/内毒素移位所致感染与随后发生的脓毒症及多器官功能不全密切相关。⑸凝血功能紊乱：与炎症反应相互促进构成脓毒症发生、发展的关键因素。内毒素和TNF诱发巨噬和内皮细胞释放组织因子，可激活外源性凝血途径，被激活的凝血因子进一步激活内源性凝血途径，最终导致弥漫性血管内凝血。⑹基因多态性：临床上常见受到同一致病菌感染的不同个体的临床表现和预后截然不同，提示基因多态性等遗传因素也是影响人体对应激打击易感性与耐受性、临床表现多样性及药物治疗反应差异性的重要因素。

由此可见，脓毒症的发病机制涉及到复杂的全身炎症网络效应、基因多态性、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤以及宿主对不同感染病原微生物及其毒素的异常反应等多个方面，与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关。

3 脓毒症的临床诊断及动物模型的建立

脓毒症既往的诊断标准为“感染+SIRS表现”，但该诊断指标过于敏感。目前临床上诊断成人脓毒症要求有明确感染或可疑感染，加上以下指标：⑴全身发热(>38.3℃)或低体温(＜36℃)，心率增快(>90次/min)或>年龄正常值之上2标准差，呼吸增快(>30次/min)。意识改变，明显水肿或液体正平衡> 20 mL/kg，持续时间超过24 h。高血糖症(血糖>7.7mmol/L)而无糖尿病史。⑵炎症指标。白细胞增多(>12×109/L或白细胞减少(＜4×109/L)或白细胞正常但不成熟细胞>10%，血浆C反应蛋白>正常值2个标准差，血浆降钙素原>正常值2个标准差。⑶血流动力学指标。低血压(收缩压＜90 mmHg，平均动脉压＜70 mmHg或成人收缩压下降>40 mmHg，或低于年龄正常值之下2个标准差)。混合静脉血氧饱和度(SvO2)> 70%，＜90%；心脏指数(CI)>3.5 L·min-1·m-2。⑷器官功能障碍参数。氧合指数(PaO2/FiO2)＜300，急性少尿(尿量＜0.5 mL· kg-1·h-1)，肌酐增加≥44.2 μmol/L，凝血功能异常(国际标准化比值>1.5或活化部分凝血活酶时间>60 s)。肠麻痹，肠鸣音消失。血小板减少(＜100×109/L)，高胆红素血症(总胆红素> 70 mmol/L)。⑸组织灌注参数。高乳酸血症(>3 mmol/L)，毛细血管再充盈时间延长或皮肤出现花斑。

常用的脓毒症动物模型有：细菌或内毒素攻击模型，肺炎和腹膜炎模型，盲肠结扎穿模型，腹腔接种细菌模型(腹腔多种属动物粪便接种)。其中盲肠结扎穿孔术模型是模拟人类阑尾炎或憩室炎穿孔的病例，造成革兰阴性细菌混合性感染或以革兰阴性细菌感染为主的混合性感染，坏死组织可成为炎症反应来源，被认为是进行脓毒症研究的金标准[6-7]。盲肠结扎穿孔术模型的主要步骤为：⑴腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。⑵备皮、消毒、铺单后，在腹部腹中线处作一2.5 cm长的切口，暴露盲肠。⑶距盲肠末端约2.5 cm处用O#丝线结扎盲肠(占盲肠总长2/3)，同时结扎盲肠肠系膜静脉。⑷在被结扎盲肠的正中处用使用套管针(14#、18#或22#)针芯对穿盲肠两次，在穿刺后需轻压盲肠，挤出少量盲肠内容物。⑸还纳盲肠，4-0丝线关腹。先内皮连续缝合，后外皮单个缝合，目的是防止大鼠咬断缝合线造成损伤。⑹术毕，所有大鼠均皮下注射生理盐水4 mL以补充正常的饮食、饮水。

造模成功与否，首先要对造模大鼠的死亡率进行检测。造模大鼠随时间的变化的死亡率，直接关系到造模大鼠能否进行有效的实验[8]。通过改变穿孔大小、盲肠结扎程度、盲肠内容物外流量及不同操作手法，使模型大鼠生存时间主要集中在48 h以内，生存率约为30%～80%，为实验提供了较理想的存活期和生存率，可较好地满足实验要求。要进一步检测造模是否成功，还需要检测更多的生理指标，以动态了解脓毒症对大鼠肺功能、肝功能和肾功能的影响，于预设时间点(CLP术后6 h、12 h、18 h以及24 h)分别检测了大鼠血气分析、肝肾功及HE病理切片，术后18 h相比，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。同时HE染色切片可见中度炎症细胞浸润或肾小管上皮细胞坏死。因此，造模最佳采血时间点和组织切片制作时间点的选择也很重要[9]。

4 脓毒症代谢组学生物样品的采集、检测

代谢组学研究的样本可以是生物体液样本(尿液、血清、血浆、脑脊液、唾液等)，组织样本匀浆(肝脏、肾脏、脑垂体、脾脏)，甚至细胞。当今代谢组学的两大主流领域是metabolomics和metabonomics，前者一般以细胞做研究对象，后者则更注重于动物的体液和组织。脓毒症代谢组学的研究主要集中在生物体液样本，样品多为尿液或血液，动物实验中尿液的采集主要应用代谢笼法。

脓毒症代谢组学的常用检测方法为核磁共振(NMR)和液质联用(LC/MS)技术。LC/MS能鉴别和分析各类化合物及其在复杂生物样品基质中含量极低的代谢物类型，具有灵敏度高、结构定性能力强、并可实现众多代谢物的快速分离与分析等优点。Lin等[10]利用H-NMR代谢组学方法，对脓毒症大鼠进行的早期检测。Li等[11]利用H-NMR代谢组学研究，按照中药清热解毒和凉血活血原则处理脓毒症大鼠代谢的变化。该研究潜在的代谢生物标记表明：脓毒症大鼠的多个代谢途径发生紊乱，此项研究也证明了利用核磁共振代谢组学研究中药药效和机制的可行性。Liu等[12]利用UPLC-Q-TOF-MS研究热烧伤和脓毒症大鼠的代谢组学。Seymour等[13]利用UHPLC/MS/MS和GS/MS研究脓毒症和肺炎的代谢组学。

5 脓毒症代谢组学确定的生物标记物

代谢组学采集的海量数据，形成一个庞大的数据集合，需要采用化学计量学和生物信息学技术进行数据预处理和建模分析。数据预处理过程包括归一化、数据转化、中心化、标准化等步骤，是后续单维和多维统计分析、生物标记物筛选的重要前提。多元统计方法有非监督方法和监督方法。主成分分析(PCA)是最为常用的非监督方法，正交偏最小二乘法(OPLS)是最为常用的监督方法，两者同时对数据进行分析，可减少工作量并提高数据的可靠性。

脓毒症代谢组学最早确定可用于检测的生物标记物是C-反应蛋白，但是其专一性不高；原降钙素比C-反应蛋白专属性[14]、预测性更高，但是其可行度仍待研究。利用代谢组学区分脓毒症和外周炎症反应依旧存在困难，有关脓毒症代谢组学生物标记物的研究仍在进行中。

Pierrakos等[15]通过查阅文献，找到了3370多篇有关脓毒症代谢组学的文献，经整理发现，脓毒症已报道的生物标记物有170多个，其中18个仅在实验中得到，58个在实验室和临床均可检测到，101个仅在临床中检测到。在这些标记物中，目前有34个标记物已用于脓毒症的诊断，但只有5个灵敏度和特异性超过90%。Schmerler等[14]利用靶向代谢组学，分析脓毒症病人与外周炎症病人的不同。该实验采用LC-MS/MS检测了186个代谢物，并将之分成六类(酰基肉毒碱、氨基酸、生物胺类、甘油磷脂、鞘磷脂、碳水化合物)，结果显示有2个代谢物(丙三基磷脂酰胆碱、酰基肉毒碱)的浓度明显高于SIRS，这有利于区分感染型和非感染性炎症。

6 脓毒症代谢组学应用研究

代谢组学的研究已广泛地应用于生物学和医学相关很多领域。近年来有关脓毒症代谢组学研究也不断增加。脓毒症的预后评估具有相当挑战性，找到一个或几个敏感的和具体的预测标志物，在脓毒症的早期预测中至关重要，这也是有关脓毒症代谢组学研究的重要组成部分。有学者利用代谢组学研究给药后脓毒症大鼠代谢物变化，来判断用药是否有效，或区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的脓毒症的不同等。Lehmann等[16]研究服用类固醇类药物脓毒症大鼠的代谢组学，表明代谢物指纹分析可以用于服用类固醇类药物脓毒症大鼠的生物标记物的寻找，并指导类固醇类药物对脓毒症大鼠的治疗。Kinross等[17]研究利用代谢组学研究肠菌引起的脓毒症和多器官功能障碍综合征，结果表明肠菌在术后脓毒症的发展中有着重要的作用。随着现代分析手段的进步和代谢物数据分析平台的完善，有关脓毒症代谢组学的研究必将日趋活跃，所涉及的领域也将更加广泛。

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（收稿：2014-06-10 修回：2014-11-12）

（责任编辑 王 丰）

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R631

A

1007-6948(2014)06-0664-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.06.037

1.天津中医药大学（天津 300193）

2.天津市南开医院（天津 300100）

3.天津国际生物医药联合研究院中药新药研发中心（天津 300457）

马军宏，E-mail：majunhong1999@163.com