长链非编码RNA在胰腺癌中的研究进展

马玲 田孝东 刘笑然 杨尹默

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)被认为是基因转录中无功能的副产物，长期以来对其重视不足。近年来发现此类不编码蛋白的、长度大于200nt的转录本不仅在表观遗传学修饰、转录与转录后调控、维持正常组织的发育和分化中发挥重要作用，而且通过调控细胞周期与凋亡影响肿瘤细胞的生长、迁移与侵袭，有望成为潜在的诊断标志物与治疗的靶点。

一、lncRNA概述

从生物基因组中转录出的转录本可以分为两种：编码蛋白质的信使RNA和非编码RNA。生物的级别越高，非编码RNA在基因组中所占比例越大，如在酵母中约占30%，而在人类基因组中已达到98%，但是后者所编码的蛋白质数量却并没有远远超过前者[1]。因此，造成物种差异性的原因可能并不是蛋白质序列的不同，而是大量的非编码RNA在其中起了重要的调控作用。

非编码RNA包括长度约为20nt的microRNA以及转录本长度大于200nt的lncRNA，它们共同的特点为不编码蛋白质，可以定位于细胞核、细胞质及不同的细胞器中。目前对microRNA的研究已经相对成熟，但对lncRNA的研究开始较晚。2002年Okazaki等[2]在对小鼠cDNA文库的测序中首次发现lncRNA并开始对其功能和分子机制进行系统研究。

lncRNA的序列保守性差，表达具有时空和组织特异性。其生物学来源广泛：(1)大部分lncRNA是由蛋白质编码基因的结构中断而形成；(2)经染色质重组，两个未转录的基因与另一独立的基因并排重组而产生含多个外显子的lncRNA；(3)非编码基因在复制过程中的反移位产生lncRNA；(4)由局部的复制子串联产生lncRNA；(5)基因中插入一个转座成分而形成有功能的lncRNA[3]。

根据lncRNA在基因组中相对于编码基因所在的位置可分为以下几种类型：正义(sense lncRNA)、反义(antisense lncRNA)、双向(bidirectional lncRNA)、基因内区(intronic lncRNA)、基因间区(intergenic lncRNA)等。lncRNA位置的不同决定了其功能上的差异。

二、lncRNA的功能

lncRNA可对DNA、RNA以及蛋白质进行多个层面的调控，构成复杂而精细的调节网络，使遗传信息的表达在空间与时间上具有无限可能性。

1．表观遗传学：lncRNA具有印迹基因的作用，可以确保本条染色体上的等位基因获得表达，从而维持胚胎发育和个体的正常生长。印迹的丢失常可导致肿瘤的形成。如Wilms'瘤患者的印迹基因H19不表达，而H19上游的IGF2过表达[4]。在剂量补偿方面，已经证明X染色体失活是一种lncRNA的反义链转录调控模式。Xist(X inactive specific transcript)基因编码一段约17kb大小的lncRNA，从转录位点开始顺式附着于染色质，扩散分布于整条染色体导致染色质异化，从而使X染色体失活[5]。

2．转录调控：位于蛋白质编码基因上游启动子区的lncRNA可以通过干扰与转录因子的结合抑制下游基因的表达，或者通过诱导组蛋白修饰或染色体重塑来抑制或促进编码基因的转录。瞬时的lncRNA转录也会对基因表达造成长期的影响，产生级联反应。lncRNA可作为共因子调节转录因子的活性。lncRNA还可以通过与影响启动子结合的抑制性复合物相互作用，封锁启动子区域来调控RNA聚合酶的活动从而干扰基因表达[6]。

3．转录后水平调控：lncRNA与RNA结合蛋白(RNA-binding proteins)结合形成RNA-蛋白质复合体，参与RNA剪接、转运，维持RNA的稳定及降解和翻译控制等RNA代谢的各个方面，同时也可以调控RNA结合蛋白的活性，并影响其细胞亚定位。lncRNA与编码蛋白基因的转录产物形成互补双链，以掩盖mRNA的主顺式作用元件，从而调控基因表达。同时lncRNA可以指导前体mRNA产生不同亚型，如核内的肺腺癌转移相关转录子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT-1)可以通过改变SR剪接因子的磷酸化状态来调控mRNA的可变剪接[7]。作为许多小分子RNA的前体，lncRNA还可以在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA、miRNA、piRNA等，调控基因的表达水平。

三、lncRNA在肿瘤形成中的作用

已证明多种lncRNA在不同肿瘤组织中的表达水平有显著差异，具有特异性，这些lncRNA可望成为新的肿瘤标志物或治疗靶点。lncRNA在肿瘤形成中的作用具有两面性，有些可作为“癌基因”在不同层面启动肿瘤的形成，而另外一些则起着类似“抑癌基因”的作用。

1．lncRNA对肿瘤形成的促进作用：(1)促进肿瘤细胞的迁移和侵袭：HOX转录反义RNA(HOX transcript antisenseRNA，HOTAIR)是第一个被发现具有反式转录调控作用的lncRNA，在乳腺癌、结肠癌、肝癌等恶性肿瘤中均有特异性表达，其表达水平的上调与肿瘤的转移具有相关性。Gupta等[8]发现乳腺癌MDA-MB-231细胞系中HOTAIR的过表达可以促进细胞的体外侵袭和体内转移。HOTAIR通过改变染色体状态，将多梳蛋白抑制复合体(polycomb repressive complex2，PRC2)招募到854个基因上(一般情况下这些基因是不与PRC2结合的)，并与PRC2通路的成员SUZ12、EZH2、H3K27me3关系密切，导致了包括HOXD10、PGR、原钙黏附蛋白基因家族在内的许多转移抑制基因被表观抑制进而表达下调。Geng等[9]在肝细胞癌(HCC)细胞系Bel7402中敲除HOTAIR可以减少细胞增殖，并可降低基质金属蛋白酶9和血管内皮生长因子的蛋白水平，两者在细胞迁移和肿瘤转移中有重要作用。Tano等[10]报道，沉默非小细胞肺癌细胞株A549的MALAT-1的表达可降低肺癌细胞的迁移能力，并影响很多与细胞迁移相关基因的表达，如CTHRC1、CCT4、HMMR以及ROD1等。在MALAT-1敲除的细胞系中，一些mRNA前体的表达水平有所降低。因此认为MALAT-1可在转录及转录后水平调控与细胞迁移相关的基因表达来促进细胞迁移。(2)调控细胞周期及凋亡：Li等[11]在食管鳞状上皮癌(ESCC)细胞系KYSE510和KYSE180中敲除HOTAIR后降低了细胞克隆形成、迁移和向细胞外基质侵袭的能力，改变了周期进程，增加了细胞对凋亡的敏感性。基因芯片检测结果显示，HOTAIR在肿瘤形成中调控细胞迁移和周期的重要区域有富集现象。Yang等[12]在HCC中发现了一种特异性高表达的lncRNA，称为lncRNA-HEIH(lncRNA high expression in HCC)，通过体内、体外实验验证，lncRNA-HEIH可以将肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期，有效地抑制肿瘤细胞增殖，并且通过结合zeste同源染色体2(EZH2)招募PRC2，进而抑制EZH2靶基因的表达，发挥调控细胞周期的功能。细胞周期激酶抑制因子4b(INK4b)位点的反义非编码RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 Locus，ANRIL)已被证实存在于pl5/CDKN2B-p16/CDKN2A-pl4/ARF基因簇中，其表达与INK4a的表观遗传学沉默相关，而INK4b-ARF-INK4a位点在调控细胞周期、细胞衰老、干细胞的自我更新和凋亡中具有重要的作用[13]。(3)促进肿瘤的血管生成：Yuan等[14]发现lncRNA-MVIH(lncRNA associated with microvascular invasion in HCC)不仅在HCC中表达上调，而且与微血管及淋巴结转移关系密切。小鼠移植瘤模型显示，MVIH可以通过抑制磷酸甘油激酶1(PGK1)来激活肿瘤诱导的血管生成从而促进肿瘤生长和肝内转移。

2．lncRNA对肿瘤形成的抑制作用：母系印迹基因MEG3定位于14q32.3，是少数与抑制肿瘤相关的lncRNA之一，在人类多数正常组织中均有不同程度的表达，脑组织和垂体中表达最高，而在肿瘤组织及细胞株中表达缺失。MEG3在Hela、MCF-7和H4等肿瘤细胞系中的异常表达可以抑制肿瘤的生长，说明MEG3有潜在的抑制肿瘤细胞生长的功能。Braconi等[15]通过使用基因芯片对肝癌细胞进行分析后发现，在23 000多条lncRNA中，有712条下调，而母系表达基因(MEG3)下调了210倍。且MEG3在4种人类肝癌细胞系中均有显著下调，但在非肿瘤细胞的胞质中高表达。将MEG3转染至肝癌细胞高表达，发现肝癌细胞生长受到明显抑制，其分子机制与诱导肝癌细胞凋亡有关。

Huang等[16]发现了一种在HCC中表达下调的lncRNA-lncRNA-Dreh，可以抑制HBV相关性肿瘤的生长和转移。lncRNA-Dreh可与中间丝蛋白结合并抑制其表达，通过改变正常细胞骨架结构来抑制肿瘤转移。

Mourtada-Maarabouni等[17]发现一种反式调控lncRNA——生长休止特定转录5(growth arrest-specific transscript 5，GAS5)，对控制哺乳动物的细胞凋亡和增殖有重要作用，可提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性而促进凋亡，同时抑制肿瘤细胞增殖。GAS5的转录水平在乳腺癌标本及细胞系中均有明显下调，从而促进了肿瘤的生长。

四、lncRNA与胰腺癌

1．HOTAIR：目前已知HOTAIR参与了多种肿瘤的生物进程，是一个重要的肿瘤预后影响因素。Kim等[18]首次在胰腺癌中检测了HOTAIR的表达，结果发现，胰腺癌中HOTAIR表达水平上升，而且与肿瘤恶性程度(TNM分期)和不良预后相关。HOTAIR在胰腺癌不同细胞系中表达水平有差异，如在PANC1和L3.6pL中明显升高，而在PANC28、MiaPaCa-2和BxPC3中低表达。功能学实验证实HORAIR可减少细胞增殖和肿瘤侵袭力，改变细胞周期进程，并且诱导凋亡。在胰腺癌细胞系PANC1中敲除HOTAIR后，有20个重要的基因群因此发生了变化，而其中10个与调控细胞周期有关；在L3.6pL中敲除HOTAIR还可在体积和重量上抑制小鼠体内移植瘤的生长。基因芯片分析结果显示，HOTAIR在胰腺癌和乳腺癌中调控的基因群有部分重叠，但其作用位点并不完全相同，HOTAIR和PRC2在胰腺癌中主要共同调控基因GDF15。通过敲除两个细胞系EZH2，并运用免疫共沉淀分析后发现，HOTAIR介导的基因抑制既有PCR2依赖性也有非PCR2依赖性。此研究证明HOTAIR在胰腺肿瘤中不仅是一种原癌基因，而且在不同肿瘤的形成中存在多种调控机制。

2．H19：印迹基因H19在个体胚胎发育阶段有高表达，出生后即表达受抑，然而在许多肿瘤组织发现其有高表达。Sorin等[19]发现H19在85%的胰腺癌组织中有中、高度表达，因此设计了BC-819(或称DTA-H19)联合吉西他滨用于治疗胰腺癌动物模型的实验方案。BC-819是一种携带编码白喉毒素A链(DTA)的双链DNA质粒，而DTA的基因转录是由H19启动子调控的，因此可应用于治疗H19高表达的肿瘤。BC-819已经在人体膀胱癌的临床研究中成功抑制了肿瘤的生长[20]，并且证明BC-819可直接介导细胞毒作用于肿瘤细胞，不会影响周围正常组织。BC-819和吉西他滨均可影响细胞生长，吉西他滨在上游干扰有丝分裂中DNA的合成，而BC-819在下游对H19高表达的肿瘤细胞抑制其蛋白质合成，诱导凋亡。在地鼠原位胰腺癌的病理切片中可以看到，经BC-819和吉西他滨联合治疗，肿瘤组织坏死区域明显扩大。双药联合不仅可以延缓肿瘤进程，缩小肿瘤体积，增加其可被手术切除的概率，而且经联合治疗的胰腺癌动物均未出现肉眼可见的肿瘤转移。但是BC-819的注射只会起到局部效应，必须结合药物化疗才能增加肿瘤对药物的反应和改善预后。Amit等[21]发现对于H19表达较低的肿瘤采用H19与IGF2双启动子调控的毒素载体H19-DTA-(IGF2)-P4-DTA，抑制肿瘤的效果更好。Hanna等[22]将BC-819应用于9例不可切除及无转移的局部进展期胰腺癌病例的临床治疗，结果发现经过BC-819局部注射后接受化疗或放疗的2例患者，其原发肿瘤降期并可被手术切除，其余患者或局部肿瘤反应良好或未再进展，因此研究者认为经超声或CT引导下BC-819局部注射(每周2次、每次剂量至少为8 mg)联合化疗可使胰腺癌患者显著受益。

3．MALAT-1：MALAT-1在很多肿瘤组织中表达上调，如肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌和宫颈癌。而目前尚无MALAT-1与胰腺癌相关性的直接研究结果，但有多篇文献报道了可能受MALAT-1调控的几种转录因子的表达水平在胰腺癌中有显著变化。潜在的肿瘤抑制转录因子RUNX1(21q22.3，又称为AML1)在胰腺癌组织中表达丢失[23]。Zhang等[24]在胰腺癌细胞系中敲除Snail后通过诱导凋亡抑制了肿瘤细胞和移植瘤的生长，并且增加了对化疗药物和放射治疗的敏感性，提示转录因子Snail与胰腺癌的抗凋亡及化疗抵抗有关。通过生物信息学分析发现，RUNX1和Snail都在MALAT-1上游1 kb启动子序列潜在的转录因子结合位点上，其TF score cutoff值为98%。另一方面，Ji等[25]发现 MALAT-1在正常胰腺、肺组织中高表达，在其他组织中中度或无表达；Yamada等[26]研究也发现MALAT-1在正常胰腺组织、肺和前列腺中都有表达，而在子宫组织中不表达。这两个研究结果间接提示，MALAT-1在胰腺癌的形成过程可能发挥了重要作用。 在对MALAT-1研究较为深入的非小细胞肺癌细胞中，此基因可促进肿瘤生长和集落的形成；干扰其表达后，肺腺癌细胞的迁移能力受到显著抑制。而在胰腺癌中，肿瘤的侵袭转移是导致其恶性程度增加及治疗困难的重要因素，因此研究MALAT-1的促肿瘤侵袭转移作用，将会是探索lncRNA在胰腺癌中分子机制的可能方向。

4．PVT1：吉西他滨是治疗进展期胰腺癌的一线化疗药物，但由于不同个体对吉西他滨的敏感性不同，使得化疗效果无法预测。You等[27]应用全基因组和基于piggyBac转座子的基因筛选平台，发现PVT1(plasmacytoma variant translocation 1 gene)为胰腺癌细胞对吉西他滨敏感性的调控因子。PVT1基因通过调控DNA重组、MYC基因共同扩增及干预部分microRNA的表达，在许多人类肿瘤的形成过程中都发挥了重要作用。piggyBac转座子载体被插入到PVT1的内含子3后，整合基因开始反义转录，导致PVT1的功能性失活，也可能导致上游的MYC转录产物的潜在功能性失活。反义全长的PVT1 cDNA在初始胰腺癌细胞系AsPC-1中过表达后导致的功能性PVT1失活可以增加肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性；而在正义方向过表达此基因可降低该细胞对吉西他滨的敏感性。

5．其他：人类基因组中，基因内区和基因间区lncRNA在调控肿瘤组织基因表达方面所起的作用不尽相同，两者在胰腺癌中的表达模式和生物关联性也有差异。Tahira等[28]运用基因芯片等生物信息学技术分析了38例胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤组织和非肿瘤组织标本后发现，基因内区和基因间区lncRNA在两者中都有表达。承载基因间区lncRNA的基因位点在PDAC中有差异性表达，这些基因位点在组成MAPK通路的基因群处富集，可能与MAPK通路调控的肿瘤转移相关。定向特异性RT-PCR结果显示，基因内区lncRNA可以通过正义、反义、双向机制与编码蛋白质的mRNA进行相互作用。一些基因内区lncRNA如PPP3CB、MAP3K14、DAPK1等基因位点在转移癌灶中有差异性表达。PDAC或转移癌的发生与胰腺组织中基因间区lncRNA的丰度有相关性，提示这类转录产物与胰腺癌的生物进程、恶性转化和转移有潜在的关系。

lncRNA与肿瘤的相关性及其分子机制的研究目前虽刚刚起步，但已发现多种恶性肿瘤中都有lncRNA的显著变化，推测其对肿瘤的生长调控涵盖了肿瘤发生的整个过程。一些lncRNA被认为是特定肿瘤的原癌基因、独立危险因子、预后预测参数以及治疗的新靶点。尤其在转移率高及预后差的胰腺癌中，lncRNA具有广阔的研究空间，其促肿瘤转移机制、调控对化疗药物的敏感性等问题的研究将为胰腺癌的诊断和治疗带来重大突破。由于lncRNA的数量、种类繁多，结构复杂，保守性较差，功能状态未知等因素的影响，需要研究者采用更合理有效的实验方案及技术来确保实验结果的可靠性，以期为包括胰腺癌在内的恶性肿瘤筛选出更多的具有更高特异性的lncRNA。

参 考 文 献

[1] Struhl K．Transcriptional noise and the fidelity of initiation by RNA polymeraseⅡ[J]．Nat Struct Mol Biol，2007，14(2)：103-105.

[2] Okazaki Y，Furuno M，Kasukawa T，et al．Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs[J]．Nature，2002，420(6915)：563-573．

[3] Ponting CP，Oliver PL，Reik W．Evolution and functions of long noncoding RNAs[J]．Cell，2009，136(4)：629-641.

[4] Steenman MJ，Rainier S，Dobry CJ，et al．Loss of imprinting of IGF2 is linked to reduced expression and abnormal methylation of H19 in Wilms′ tumour[J]．Nat Genet，1994，7(3)：433-439.

[5] Kay GF，Penny GD，Patel D，et al．Expression of Xist during mouse development suggests a role in the initiation of X chromosome inactivation[J]．Cell，1993，72(2)：171-182.

[6] Feng J，Bi C，Clark BS，et al．The Evf-2 noncoding RNA is transcribed from the Dlx-5/6 ultraconserved region and functions as a Dlx-2 transcriptional coactivator[J]．Genes Dev，2006，20(11)：1470-1484.

[7] Tripathi V，Ellis JD，Shen Z，et al．The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation[J]．Mol Cell，2010，39(6)：925-938.

[8] Gupta RA, Shan N, Wang KC, et al． Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J]．Nature，2010，464(7291)：1071-1076.

[9] Geng YJ，Xie SL，Li Q，et al．Large intervening non-coding RNA HOTAIR is associated with hepatocellular carcinoma progression[J]．J Int Med Res，2011，39(6)：2119-2128．

[10] Tano K，Mizuno R，Okada T，et al．MALAT-1 enhances cell motility of lung adenocarcinoma cells by influencing the expression of motility-related genes[J]．FEBS Lett，2010，584(22)：4575-4580．

[11] Li X，Wu Z，Mei Q，et al．Long non-coding RNA HOTAIR，a driver of malignancy，predicts negative prognosis and exhibits oncogenic activity in oesophageal squamous cell carcinoma[J]．Br J Cancer，2013，109(8)：2266-2278．

[12] Yang F，Zhang L，Huo XS，et al．Long noncoding RNA high expression in hepatocellular carcinoma facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2 in humans[J]．Hepatology，2011，54(5)：1679-1689．

[13] Pasmant E，Sabbagh A，Vidaud M，et al．ANRIL，a long，noncoding RNA，is an unexpected major hotspot in GWAS[J]．FASEB J，2011，25(2)：444-448.

[14] Yuan SX，Yang F，Yang Y，et al．Long noncoding RNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinoma promotes angiogenesis and serves as a predictor for hepatocellular carcinoma patients′ poor recurrence-free survival after hepatectomy[J]．Hepatology，2012，56(6)：2231-2241.

[15] Braconi C，Kogure T，Valeri N，et al．MicroRNA-29 can regulate expression of the long non-coding RNA gene MEG3 in hepatocellular cancer[J]．Oncogene，2011，30(47)：4750-4756.

[16] Huang JF，Guo YJ，Zhao CX，et al．Hepatitis B virus X protein (HBx)-related long noncoding RNA (lncRNA) down-regulated expression by HBx (Dreh) inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by targeting the intermediate filament protein vimentin[J]．Hepatology，2013，57(5)：1882-1892.

[17] Mourtada-Maarabouni M，Pickard MR，Hedge VL，et al．GAS5，a non-protein-coding RNA，controls apoptosis and is downregulated in breast cancer[J]．Oncogene，2009，28(2)：195-208.

[18] Kim K，Jutooru I，Chadalapaka G，et al．HOTAIR is a negative prognostic factor and exhibits pro-oncogenic activity in pancreatic cancer[J]．Oncogene，2013，32(13)：1616-1625.

[19] Sorin V，Ohana P，Gallula J，et al．H19-promoter-targeted therapy combined with gemcitabine in the treatment of pancreatic cancer[J]．ISRN Oncol，2012，2012：351750.

[20] Sidi AA，Ohana P，Benjamin S，et al．Phase Ⅰ/Ⅱ marker lesion study of intravesical BC-819 DNA plasmid in H19 over expressing superficial bladder cancer refractory to bacillus Calmette-Guerin[J]．J Urol，2008，180(6)：2379-2383.

[21] Amit D， Hochberg A．Development of targeted therapy for a broad spectrum of cancers (pancreatic cancer，ovarian cancer，glioblastoma and HCC) mediated by a double promoter plasmid expressing diphtheria toxin under the control of H19 and IGF2-P4 regulatory sequences[J]．Int J Clin Exp Med，2012，5(4)：296-305.

[22] Hanna N，Ohana P，Konikoff FM，et al．Phase 1/2a， dose-escalation， safety，pharmacokinetic and preliminary efficacy study of intratumoral administration of BC-819 in patients with unresectable pancreatic cancer[J]．Cancer Gene Ther，2012，19(6)：374-381.

[23] Birnbaum DJ，Adelaide J，Mamessier E，et al． Genome profiling of pancreatic adenocarcinoma[J]．Genes Chromosomes Cancer，2011，50(6)：456-465.

[24] Zhang K，Jiao X，Liu X，et al．Knockdown of snail sensitizes pancreatic cancer cells to chemotherapeutic agents and irradiation[J]．Int J Mol Sci，2010，11(12)：4891-4892.

[25] Ji P，Diederichs S，Wang W，et al．MALAT-1，a novel noncoding RNA，and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer[J]．Oncogene，2003，22(39)：8031-8041.

[26] Yamada K，Kano J，Tsunoda H，et al．Phenotypic characterization of endometrial stromal sarcoma of the uterus[J]．Cancer Sci，2006，97(2)：106-112.

[27] You L，Chang D，Du HZ，et al．Genome-wide screen identifies PVT1 as a regulator of Gemcitabine sensitivity in human pancreatic cancer cells[J]．Biochem Biophys Res Commun，2011，407(1)：1-6.

[28] Tahira AC，Kubrusly MS，Faria MF，et al．Long noncoding intronic RNAs are differentially expressed in primary and metastatic pancreatic cancer[J]．Mol Cancer，2011，10：141.