肝细胞肝癌免疫微环境的研究进展

姚蓉蓉 王艳红

(复旦大学附属中山医院肝肿瘤内科，上海 200032)

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，居全球癌症患者病死率的第三位，仅次于肺癌和胃癌，每年新增病例超过750 000 例[1]。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的原发性肝癌。HCC患者的主要死因是癌细胞的扩散与转移。近年来，肿瘤细胞所处的微环境对肿瘤发生发展的影响受到关注[2]。HCC发病的危险因素很多，包括肝炎病毒感染、非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病、血色素沉着病，氯乙烯、黄曲霉毒素等的误食，过量饮酒或咖啡以及过量吸烟等。这些危险因素可导致DNA突变、染色体重组和表观遗传学改变等，且可使肿瘤微环境发生改变，进而形成类型各异、预后不同的肝癌[3]。目前，外科手术仍是提高HCC患者生存率的主要手段，但术后复发率和转移率高[4]。近年来，涌现出不少通过改变肿瘤微环境治疗HCC的相关研究，如有研究[5]指出，地塞米松通过调控11β-羟化类固醇脱氢酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase，11β-HSD)的表达能对HCC起治疗作用。因此，进一步研究HCC的微环境，并据此预测HCC细胞的表型特点，可为HCC的分子靶向治疗提供理论支持，这对于研发新的抗癌策略以及新的分子靶向药物至关重要。

1 肿瘤微环境的组成及其重要性

HCC微环境是个极其复杂的综合系统，包含多种细胞(如肿瘤实质细胞、肿瘤相关的成纤维母细胞、肝星形细胞、肝窦内皮细胞和炎性反应细胞等)、细胞外基质、细胞因子以及其他化学分子，它们通过协同作用促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[6]。

上皮-间充质转变(epithelial-to-mesenchymal transition ，EMT)是肿瘤发病的机制之一。肿瘤细胞在生长因子作用下或与肿瘤基质相互作用过程中可发生EMT，在此过程中肿瘤细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin/CDH1)丢失，获得间充质细胞的标记分子如波形蛋白(vimentin ，VIM)等，增强肿瘤细胞的迁移性及侵袭性；EMT也可以通过促进具有干细胞特性的癌细胞的产生，进而启动转移和侵袭机制；EMT还可能与肿瘤的化疗抵抗以及复发相关。研究[7]表明，肿瘤基质细胞分泌的转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生因子(PDGF)的上调可以诱导EMT的发生及肝细胞的恶性转变，参与肿瘤形成。

此外，基质细胞中Twist、Snail、VE-钙粘素、波形蛋白的上调以及E-钙黏素、肝细胞核转录因子的下调，均与HCC的不良预后相关[8]。Kim 等[7]的研究显示，CDH1、DNA结合因子2(inhibitor of DNA binding 2,ID2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metallo-proteinase, MMP-9)、及转录因子(transcription factor 3,TCF3)的表达与HCV感染后HCC患者的预后相关，可作为HCC的分子标志物。

2 肿瘤微环境中的免疫细胞与非免疫细胞

肝脏本身就是一种独特的免疫微环境，肝脏中骨髓抑制细胞(MDSC)、树突状细胞(DC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞(Treg)等免疫细胞，以及癌症相关成纤维细胞(CAFs)、肝星状细胞(HSCs)、肝内皮细胞等非免疫细胞和细胞产物相互作用，参与HCC的免疫耐受及应答，影响其发展与预后。传统的HCC治疗方案由于未对其免疫耐受环境产生影响，疗效常不理想。因此，临床医师应充分了解HCC免疫微环境内各细胞表型以及淋巴细胞亚型，以制定出完善的免疫治疗策略和新的分子靶向药物，提高HCC的治疗效果[9]。

2.1 免疫细胞

2.1.1 MDSC MDSC是一群具有免疫抑制功能的细胞统称，通常认为它们是正常的单核/巨噬细胞、DC细胞、粒细胞等处于分化的未成熟阶段，且可以分为单核和分叶核两类。肿瘤模型小鼠中，单核类MDSC典型的标志性分子是CD11b和Ly-6C，而分叶核类MDSC的典型标志分子是CD11b和Ly-6G。在肿瘤患者中，MDSC同时表达CD11和CD33等分子，而不表达人白细胞抗原DR。肿瘤微环境诱导产生的MDSC聚集在淋巴器官、血液以及病变部位。针对不同的免疫细胞群，MDSC通过分泌抑制性因子、接触抑制以及诱导产生其他抑制性细胞等多种方式发挥免疫抑制作用[10]。

在肿瘤患者以及肿瘤模型小鼠中，MDSC存在于血液、淋巴结、脾脏、骨髓及肿瘤组织中。MDSC可由肿瘤微环境中的细胞因子诱导产生，常见的细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、前列腺素2(PGE2)等。近年研究[11]发现，IL-17在MDSC形成的免疫耐受中起重要作用，IL-17受体缺失抑制了MDSC的浸润，促进了CD8+T细胞的浸润；而巨噬细胞可以趋化MDSC细胞到肿瘤部位，促进其释放IL-17；MDSC来源的IL-17又能趋化Treg细胞到肿瘤部位，并增强其免疫抑制功能；同时，巨噬细胞可促使MDSC释放IL-9，IL-9又能进一步促使巨噬细胞存活，并增强对MDSC细胞的趋化作用。趋化因子CXCL5/ENA-78和CXCL12/SDF-1也可以募集MDSC进而导致免疫逃逸。此外，GM-CSF在MDSC细胞的产生过程中起重要的作用，GM-CSF的抗体能逆转MDSC依赖的抑制作用[9]。

MDSC诱发免疫耐受的主要机制是MDSC对NK细胞和T细胞的抑制。(1)MDSC对NK细胞的抑制：有研究[12]提示，MDSC可以通过接触性抑制的方式抑制IL-2活化的NK细胞释放细胞毒素。但也有研究[13]表明，在特定环境中，MDSC可激活NK细胞，例如，在急性肝炎中MDSC可以激活NK细胞，促进其增殖。在接种人淋巴细胞肿瘤的小鼠体内，MDSC表达的细胞表面受体RAE-1可以通过与NK细胞的表面受体NKG2D相互作用而激活NK细胞，促进其释放γ-干扰素(IFN-γ)，从而增强NK细胞的杀伤功能[14]；(2)MDSC对T细胞的抑制：MDSC通过产生精氨酸、一氧化氮、活性氧，消化T细胞受体、减少半胱氨酸、干扰T细胞转运，诱导Treg细胞生成和T细胞耐受发挥对T细胞功能的抑制作用[9]。最近研究[15]发现，肿瘤细胞可产生大量环加氧酶-2(COX-2)，COX-2可催化产生PGE2，PGE2可刺激MDSC细胞释放NADPH氧化酶(NOX2)以及精氨酸酶，营造免疫耐受微环境，促进肿瘤的发生发展；用COX-2抑制剂(非甾体抗炎药物赛利西布)喂食肿瘤模型小鼠，可以减少小鼠肿瘤组织以及全身的MDSC，并且通过降低活性氧(ROS)以及NO的水平影响MDSC的功能，从而逆转T细胞耐受；(3)MDSC与Treg细胞：MDSC细胞可以作为抗原提呈细胞，摄取、处理并向Treg细胞呈递耐受原，进而激活Treg细胞，与其联合抑制机体的免疫反应[16]。

总之，MDSC是一类不成熟的细胞，在一定条件下可转变为固有免疫细胞。目前，以MDSC为靶点的治疗策略正在研究中。(1)靶向抑制MDSC生成：一种方法是通过阻滞酪氨酸激酶受体(如SCF/c-kit)抑制MDSC、Treg细胞增殖，并减少与MDSC相关的炎性介质IL-10和TGF-β的生成，保护肿瘤特异性T细胞；或用酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼阻止荷瘤小鼠以及肾细胞癌患者体内MDSC的累积[9]；另一种方法是促使MDSC分化为成熟的表型。ATRA是维生素A的衍生物，可促使MDSC分化为成熟的DC细胞(呈递抗原诱导效应性T细胞的免疫应答)和巨噬细胞；炎性反应介质如IL-6、IL-1也可以促进MDSC细胞的成熟，抗感染治疗则可以通过阻止MDSC生成。研究[17-18]发现，IL-1受体阻滞剂或PGE2受体阻滞剂可以减少MDSC的产生和积累。(2)靶向抑制MDSC的积累：MDSC的募集受两种化学反应轴的调节，CXCL5/ENA-78-CXCR2和CXCL12/SDF-1-CXCR4(由M2型巨噬细胞和肿瘤细胞产生)。负性调节这两种反应轴可以消弱MDSC对效应性T细胞以及其它淋巴细胞的影响，还可以扩增M1型巨噬细胞的数量。针对微环境分子的免疫疗法为抑制MDSC积累的有效方法。有研究[19]报告，激活Fas通路可使MDSC和Treg细胞短暂损耗，但值得注意的是，抑制细胞上Fas通路的沉默是其本身的机制还是依赖于IL-2/anti-CD40的治疗尚需澄清。此外，一些抗肿瘤药物，如曲贝替丁能抑制促肿瘤因子、巨噬细胞募集和肿瘤血管生成；多西他赛优先靶向M2型受体阳性的MDSC细胞，而对M1受体阳性的MDSC细胞无影响，抑制荷瘤小鼠中MDSC的积累；此外，多西他赛与其他免疫疗法联合治疗也证实了此观点。吉西他滨可以通过选择性诱导凋亡清除MDSC细胞。(3)靶向抑制MDSC的功能：研究[20]报道，精氨酸、氮氧合酶2是诱导MDSC细胞产生免疫耐受的最主要物质，而硝基阿司匹林可以抑制精氨酸和氮氧合酶2的表达，从而抑制蛋白硝基化作用、组织抗原与TCR结合，扭转荷瘤小鼠的免疫状态，有望成为一种癌症疫苗。COX-2或PGE2抑制剂、IL-1阻滞剂通过减少过氧硝酸盐的活性氧产物，从而抑制MDSC的功能，逆转免疫耐受微环境。西地那非为5型磷酸二酯酶抑制剂，其通过干扰精氨酸和一氧化氮合成酶2(nitric oxide synthase 2，NOS2)，影响MDSC的免疫耐受和募集效应性CD4和CD8阳性T细胞[9]。

2.1.2 TAMs HCC中存在各种各样的免疫细胞，TAMs是肿瘤与肿瘤基质的交互作用中起主导性作用的免疫细胞，是浸润于肿瘤组织的炎性细胞的代表。TAMs起源于单核细胞前体，由肿瘤衍生分子CCL2和M-CSF募集并分化为成熟的巨噬细胞。在不同微环境信号的影响下，巨噬细胞会产生抗肿瘤活性和促肿瘤活性，与其相对应的分别为经典活化的MI型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞[21]。在微生物和干扰素的刺激下，巨噬细胞分化为M1表型，其具有较强的抗原呈递能力，高表达1L-12和其他促炎介质，激活Th1免疫应答，并通过产生有毒的中介物(如NO、ROS)来消灭微生物和癌细胞[22-23]。而在IL-4、IL-13、IL-10、糖皮质激素、Toll样受体(TLR)的配体作用下，巨噬细胞分化为M2型，其抗原呈递能力低，能分泌不同的细胞因子和趋化因子，如IL-10、TGF-β、趋化因子(CCL17、CCL22、CCL24等)，进而激活Th2免疫应答，促进血管生成组织重塑和修复；此外，M2可通过改变代谢途径促进肿瘤进展，如M2高表达的精氨酸酶可通过作用于精氨酸，使其生成鸟氨酸和多胺[23]，而鸟氨酸和多胺是肿瘤细胞生长、增殖不可缺少的原料[24]，或通过抑制杀伤性T细胞受体表达而直接抑制T细胞的免疫功能[25]。

研究[26]表明，巨噬细胞通过改变细胞表型来适应微环境，这与一些分子信号通路的改变相关，M1和M2细胞表型的改变没有明确的差异，但肿瘤微环境中，TAMs的分子表达与M2的表达一致，表现为IL-10和精氨酸-1的高表达，促炎因子、NO和ROS的低表达，且其抗原呈递能力差，因此认为，TAMs倾向于极化M2表型。研究[27-29]表明，TAMs细胞数量的增加与血管生成、肿瘤转移以及不良预后相关。此外，啮齿类动物以及人类的不同肿瘤中TAMs存在复杂交叉性表型表达，如在胃癌患者中存在IL-10和1L-12共同高表达[30]，提示与TAM表型相关的生物标志物在不同肿瘤和肿瘤不同区域存在表达差异。

2.1.3 DC DC是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞。位于肿瘤微环境中的DC，即肿瘤浸润性树突状细胞(TIDC)，可将肿瘤抗原提呈给初始T细胞并诱发特异性抗肿瘤免疫[27]。肝脏受损时，DC可产生肿瘤坏死因子(TNF)，促进T细胞增殖、NK细胞活化，进而使肝脏发生炎性反应和纤维化改变[31]；但当肝组织接触脂多糖(LPS)时，TLR-4产生的多种细胞因子可加速肝炎纤维化过程，而DC细胞则可以减少TLR4的表达[32]。有研究[33]发现，瘤内注射的巨噬细胞炎性蛋白(MIP-3α)可在小鼠肝癌病灶内趋化、募集外周的DC，使其摄取并提呈肿瘤抗原，有效诱导针对肝癌细胞的特异性免疫应答；而且MIP-3α在小鼠皮下肝癌模型的局部微环境中可能具有促进DC成熟的作用。

浆细胞样树突状细胞(pDC)是数量极少的一类免疫细胞，在机体稳态条件下，该细胞主要分布于外周血及次级淋巴器官，在皮肤、黏膜、肺等外周组织中较少发现。研究[34]表明，pDC大量分布于各种实体肿瘤中，如头颈部肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌及皮肤癌；在肿瘤微环境中，pDC不能有效地激活T细胞杀伤肿瘤细胞，反而诱导各类免疫调节性细胞产生，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸。

pDC虽然可以生成I型干扰素(IFN)诱导抗肿瘤免疫，但其更重要的作用是促进免疫耐受。pDC通过多种机制参与肿瘤的免疫逃逸。IL-10作用于pDC产生non-Th1 T极化环境以及Tregs细胞增殖均可导致T细胞低反应；而给予外源性IL-12或抗IL-10的抗体可以提高pDC刺激T细胞增殖的能力[35]。未成熟的pDC可以抑制CD4+T细胞的活化；而成熟的pDC在肿瘤微环境中可以诱导CD8+Treg的产生和聚集，分泌细胞因子IL-10，是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。COX-2和TGF-β可以阻碍pDC的成熟，因此，应用环氧合酶抑制剂和TGF-β拮抗剂能够逆转pDC功能，产生抗肿瘤免疫反应。此外，pDC也可以诱导CD4+CD25+Treg细胞产生，导致肿瘤免疫逃逸[9]。

2.1.4 其他免疫细胞 NK是一种非特异性免疫细胞，是抗肿瘤免疫系统的重要组成部分。NK细胞表达多种受体，如活化性受体(NKG2D、NKp44、NKp30、NKp46等)及抑制性受体(KIR2DL3 /CD158b、NKG2A/CD159a等)；NK细胞的杀伤作用是其表面活化性受体与抑制性受体的综合作用来实现的。但是，肿瘤微环境中，NK细胞在杀伤肿瘤细胞的同时也和肿瘤细胞发生了相互免疫编辑，导致NK表面活化性受体表达下降，抑制性受体表达增强，致使NK细胞的抗肿瘤效应减弱[36]。因此，阻断或抑制NK细胞的抑制性信号通路及增强活化性信号通路是提高NK细胞抗肿瘤效应的主要手段。研究[37]发现，将IL-12直接注射于肝癌模型小鼠瘤内，使得肿瘤微环境NK细胞活化性受体上调，同时使抑制性受体下调，而IL-12及IFN-γ的合成和分泌明显增加，抑制肿瘤生长。

枯否细胞(kupffer cell，KC)是存在于HCC肿瘤微环境中的另一种比较重要的免疫细胞，又称为清道夫细胞，属于TAMs。KC表达CD68，属CD11b+/F4/80+细胞亚系存在于肝脏，吞噬门静脉循环中的尘细胞、凋亡细胞以及微生物，与抗原结合可释放活性氧及促炎因子如TNF-α、IL-1和IL-6等。在同种异体移植中，KC通过调控免疫调节因子，如IL-10、TGF-β、吲哚胺双氧酶(IDO)、NO和Fas，诱导受体对可溶性抗原的免疫耐受[38]。研究[39]表明，KC通过调节共刺激分子B7-H1(PD-L1)的表达减轻缺血再灌注肝脏模型的炎性反应；但在肝癌中，PD-L1/PD-1轴的激活是有害的 。

Th17属CD4+T淋巴细胞，因其能产生IL-17而得名。Th17在某些特定肿瘤中含量增加[40]。Th17与肿瘤免疫机制的关系仍有争议。HCC中Th17细胞数量增加被证实与肿瘤患者的不良预后以及术后复发相关，因此推断，Th17和IL-17会促进肿瘤的进程[41]。

Treg是诱导免疫逃逸的重要细胞；CTL是抗肿瘤的免疫细胞。研究[42]发现，HCC组织中Treg细胞大量增加，且与患者的不良预后相关;Treg/CTL比例可代表局部免疫平衡状态，Treg多且CTL少者预后较差，而Treg少且CTL多者则预后较佳。

2.2 非免疫细胞 CAFs是一些肿瘤间质中最主要的细胞，参与肿瘤细胞和间质的相互作用。研究[43]发现，HCC细胞的生长、侵袭和转移是依赖CAF的，而HCC细胞也会反戈CAF的活化。CAF可以表达多种生长因子，如肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF )、内皮生长因子( endotelial growth factor,EGF)、纤维化生长因子( fibroblast growth factor,FGF)、基质细胞衍生生长因子(stromal cell-derived growth factor-1α,SDF-1α)、IL-6等[44]。

HSCs会活化核因子-kB(NF-kB)以及细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路，促进癌细胞增殖、减少中心坏死。Amann等[45]已经证实了HCC细胞促进HSC活化的机制。此外，HSC和HCC的共刺激分子，如VEGF-A、MMP-2，可以刺激HSC的增殖、迁移及促血管生成因子的表达。HBV-X蛋白、HCV非结构蛋白、MMP-9、PDGF、TGF-β1、JNK、胰岛素样生长因子蛋白5、组织蛋白酶B和组织蛋白酶D都是HSCs活化的潜在诱导物质[46]。癌旁HSCs活化是肝癌不良预后的独立预测因素[47]。

肝窦内皮细胞是一种特殊的上皮细胞，是肝脏中除KCs及DCs以外的第三种抗原递呈细胞。在HCC组织和正常肝组织中，内皮细胞存在分子表型和功能上的差异；肿瘤相关的内皮细胞活力增强能够进入快速地循环、迁移；参与肝癌中窦壁毛细血管化的形成，并且高表达CD105和TGF-β1，促进肿瘤的发生[48]。HCC组织中的内皮细胞与正常肝组织中内皮细胞的不同之处还在于：前者高表达多种血管受体，如VEGFR、Tie-2、EGFR、PDGFR、CXCRs等。此外，HCC内皮皮细胞还高表达TGF-β1和CD105，其与化疗药物耐受相关[49]。

3 肿瘤微环境中涉及的非细胞组分：炎性介质与胞外基质

HCC是典型的炎性相关性恶性肿瘤，肝炎病毒是HCC形成的主要危险因素。肝炎病毒所致肝脏慢性炎性环境以持续性表达细胞因子和募集免疫细胞为特点，而肝细胞表面存在多种细胞因子受体，易受细胞因子的调控；其次，肝脏非实质细胞也可以合成多种细胞因子，由这些细胞因子形成的微环境会影响免疫细胞的活性；此外，肝窦内皮细胞也可以产生细胞因子并受其调控。因此，肝癌微环境中各种细胞分泌的炎性因子、趋化因子以及ECM非细胞成分可能都参与致癌过程[49]。

3.1 炎性因子

3.1.1 IL-6 IL-6是一种多效细胞因子，参与免疫调节、炎性反应、肿瘤形成等多个生物过程。研究[50]发现，用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)处理小鼠，受损肝细胞释放IL-1α，促使KC释放IL-6，使存活的肝细胞非正常增生，促进HCC的发生和发展。IL-6可以激活下游STAT-3和ERK通路产生致癌作用[51]。此外，慢性乙型肝炎患者血清中，高水平IL-6者患HCC的风险较高；HCC患者血清中高水平IL-6与其不良预后相关[51]。雌激素能抑制IL-6的释放，这一现象可以解释为何肝癌发病率存在性别差异[52]。动物实验[53]中，肥胖症小鼠的IL-6高表达，从而使其信号通路活化，这或许可以解释为何肥胖症患者HCC的发病率高。IL-6还具有促转移的作用，有利于EMT进程，血清中高水平IL-6可以用于区分初发肿瘤和转移癌。IL-6还具有免疫抑制作用，同其他细胞因子影响T细胞亚型的分化[23]。研究[54]表明，TAMs释放的IL-6和IL-1β可以促进Th17细胞增殖；高水平的Th17与HCC患者的肿瘤微血管密度和不良预后相关。

3.1.2 TNF-α 肝受损与肝切除后，巨噬细胞产生TNF-α不仅是肝细胞再生的基础，而且参与HCC的发病、侵袭、转移。已证实，在炎性反应诱导的小鼠模型中，TNF-α可以促进HCC发展；在小鼠体内输入TNF-α抗体后则可以抑制其发展。在DEN诱导的HCC模型中，TNF-α同IL-6对肝脂肪变性和脂肪性肝炎所导致的肥胖相关性HCC有促进作用；而阻断TNF-α信号通路后则可以减缓HCC进程[55]。此外，TNF-α还可以诱导P38(MAPK)、ERK、Akt的磷酸化以及IL-8的合成，刺激肿瘤炎性微环境关键成分的CAF的活化和Th17的增殖[56]。

另外，TNF-α和IL-1β通过诱导肝癌细胞表面TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related Apoptosis-inducing Ligand，TRAIL)，导致活化T细胞凋亡；TNF-α也刺激负性共刺激分子B7-H1或程序性死亡配体PD-L1的表达，抑制CD8+T的免疫应答[39]。TNF-α的这些作用促使肿瘤细胞发生免疫逃逸。此外，NF-κB信号通路可调控下游TNF-α的表达，同时TNF-α参与诱导NF-κB的表达，形成正反馈[57]；而TNF-α单核苷酸多态性与癌症易感性相关[58]。

3.1.3 IL-10 IL-10是重要的免疫抑制因子，在HCC患者中高水平表达。IL-10和TNF-α共同刺激B7-H1的表达导致肿瘤发生免疫逃逸。此外，癌细胞表达B7-H1与HCC组织中的TAM相关，依赖于IL-10诱导的NF-κB和STAT-3信号通路。IL-10诱导FOXP3+Treg的分化，其与肿瘤的高侵袭性和患者的不良预后相关；在HCC患者中可观察到高水平的IL-10和Terg细胞；在小鼠模型中，IL-10不仅与免疫抑制相关，也与高血管活性相关[23]。

3.1.4 IL-17 IL-17通过刺激巨噬细胞表达炎性因子(如IL-10、1L-1b、TNF-α等)，进而上调B7-H1的表达而导致HCC免疫逃逸的发生。相关报道[59]表明，HCC的癌前病变组织IL-17高表达与HCC的病情发展相关，提示IL-17作为介导免疫抑制机制中的重要环节，可以成为有利的分子靶向治疗位点。

3.2 趋化因子 趋化因子和其受体调控HCC进程的机制较为复杂。常见报道的趋化因子有，CCL22、CCL20、CCL17、CCL22、CCL24、CXCL12等。

HCC患者肿瘤组织中的CCL20高于非肿瘤组织[60]。此外，肿瘤组织局部CCL22和CCL20的高表达导致Th17细胞增加，提示趋化因子可以影响免疫抑制细胞Th17的募集[61]。而HCC肝内转移率高的患者，其CCL20的受体CCR6的表达水平也高，提示CCR6与肝内转移相关，可作为肝癌切除术后复发转移的诊断因素[62]。另有研究[63]报道，CXCL12-CXCR4系统参与MMP-2、MMP-9的分泌，促进HCC的生长、侵袭和转移。此外，CXCL12通过活化CXCL12/CXCR4信号轴将Treg细胞募集到肿瘤组织[64]。CXCR4高表达与远端淋巴转移及3年生存率降低相关[65]。

3.3 HCC相关的生长因子 生长因子高表达及与这些因子相关信号通路的活化是炎性肝病和HCC的共同特征。生长因子表达异常会导致肿瘤转移，且有利于维持细胞肿瘤表型。肿瘤微环境中存在多种生长因子，它们与HCC的生成、转移、侵袭以及复发相关。常见的生长因子有：TGF-β、PDGF-β、EGFR/EGFRL、VEGF。

3.3.1 TGF-β 在HCC中，根据肿瘤分期的不同，TGF-β表现出抗肿瘤或促肿瘤的双重活性。在癌前阶段，TGF-β是肿瘤抑制物，调控抗增殖和促凋亡信号通路；而在HCC中通过不同的机制发挥促肿瘤作用。TGF-β的促肿瘤机制包括几下几种，(1)TGF-β的作用类似于IL-10，是免疫抑制分子，它可以抑制CD8+T细胞的产物INF-γ，同时与IL-6、IL-10、IL-1β协同诱导Treg生成和Th17分化，促进肿瘤生长和进展[23]；(2)TGF-β1可以活化微环境中的重要成分HSC，诱导侵袭性标志物α3β1整合素的表达。 最近研究[66-67]发现，TGF-β1可以激活局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)等，与HCC转移相关激酶的活性，促进肿瘤的转移，而阻断TGF-β1则可以抑制肿瘤的生长和转移。TGF-β1促进EMT的机制包括：TGF-β1通过下调E-钙粘蛋白、上调E-钙粘蛋白抑制物以及PDGF细胞内信号通路导致EMT发生；通过诱导N-钙粘素、波形蛋白以及HCC相关抗原CD147的表达，促进EMT的发生[66]；(3)TGF-β1通过调节microRNAs(如miR-23a、miR-27a、miR-24及miR-181b)参与了HCC的发病，通过上调MMP-2和MMP-9的表达参与HCC的侵袭和转移[68]。早期的研究已证实，HCC患者血浆和组织中有高水平的TGF-β，且与患者生存期短相关；然而，Mamiya等[69]的研究发现，在已发生肝内转移的HCC患者中，TGF-β2为低表达。因此，TGF-β与HCC的关系仍待进一步研究。

3.3.2 PDGF-β 如前所述，PDGF信号通路活化可以促进HCC中的EMT进程；PDGF-β属血管生成因子，可以促进血管生成；活化CAF和HSC，诱导HSC分化为增殖的肌成纤维细胞，导致肝纤维化继而发生HCC；此外，PDGF还可以上调双调蛋白，参与EGFR信号通路[23]。

3.3.3 EGFR 早期研究[23]表明，HCC患者中，EGFR/EGFRL高表达且与其生存率低相关。在基因修饰小鼠模型的体内实验证实，EGFR通路参与HCC的发病过程；EGFR抑制剂则可以逆转这一过程。此外，EGFR信号通路的活化诱导VEGF的生成，参与肿瘤中血管的生成[70]。

3.3.4 VEGF VEGF参与肝癌的血管生成，促进内皮细胞及表达VEGF-A受体的癌细胞的增殖[71]。Zhu等[72]所述，在HCC患者的癌细胞膜、癌组织中以及血液中都存在高水平的VEGR及其受体VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3；HCC中VEGF相关信号通路的活化与HCC血管侵袭、分期、不良预后和患者生存率有关。

3.4 其他基质成分 其他基质成分主要包括：骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、COX-2、MMPs及MMP组织抑制因子(tissue inhibitor infector of MMP，TIMP)。

OPN是一种磷酸化的酸性糖蛋白，当肝脏受损后，表达于巨噬细胞参与宿主的免疫应答；此外，OPN与整合素相互作用，调控肝脏炎性反应、肿瘤发展以及HCC的侵袭和转移。研究[73]发现，HCC患者血清中含高水平的OPN，且与肝功能减退、不良预后相关；在体内或体外应用抗OPN抗体，可以抑制HCC细胞的侵袭与转移。

COX-2涉及脂质炎性介质的合成，在HCC患者中高表达。研究[74]表明，初发HCC患者体内COX-2的表达与炎性细胞的存在相关，且炎性细胞表达COX-2参与癌症的早期阶段。

MMP-7裂解Fas配体，使其丧失诱导调亡的作用，推测MMP参与凋亡信号通路的调节[75]。此外，MMP还可以通过调控趋化因子参与炎性反应，促进肿瘤进程[46]。研究[76]表明，载脂蛋白和中性粒细胞相关载脂蛋白共同作用可以增强MMP-9的促肿瘤活性。

TIMP是MMP的抑制剂，可防止ECM过度溶解，调控细胞增殖、凋亡、血管生成以及MMP的过度活化。正常情况下，MMP和TIMP的活性处于动态平衡。研究[23, 46]表明，TIMP-1高表达可以抑制HCC细胞的增殖和侵袭；TIMP-3亦能够抑制HCC的增殖、侵袭和转移。

4 关键的信号通路

肿瘤的发生和发展与某些信号转导通路的激活或抑制有着紧密的联系，这些信号通路的激活可促成免疫耐受微环境，从而促进肿瘤发生和发展。其中肝癌信号转导通路成为研究的热点，肝癌的发生、发展及转移是长期的、多因素共同作用的连续过程，该通路涉及多种调节因子，也不是一对一的对应关系，而是各通路间相互交叉的复杂网络关系。

HCC中涉及的主要信号通路有：Hedgehog信号通路[77]、EGF/EGFR信号通路[78]、RAS/RAF/MEK/ERK信号通路[78-79]、PI3K/PTEN/AKT/mTOR信号通路[78, 80]、生长因子相关信号通路[78, 81]、IGF信号通路[78]、Wnt/β-连环蛋白信号传导通路[78, 82]、IL-6/STAT3炎性相关信号通路[78]等。此外，在部分HCC患者中存在NTS/IL-8炎性通路的异常活化，神经降压素(neurotensin，NTS)的高表达与炎性微环境形成、肿瘤EMT以及与HCC患者预后较差密切相关[83]。实验[84]表明，NF-κB、缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-α，HIF-α)以及STAT3是联系微环境与肿瘤的关键分子。

NF-κB在炎性反应和癌症之间起桥梁作用。NF-κB家族有5个成员：NF-B1(p105/p50)、NF-B2(p100/p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel，它们可以组成同源二聚体或异源二聚体，与抑制性IkB蛋白(IkB)结合存在于细胞质中，可因IkB的磷酸化而快速被活化。IkB蛋白的磷酸化受其激酶IκK复合物的调控，IκK由两种活化亚型(IκKa和IκKβ)和调节性亚型(IκKr和NEMO)构成。NF-κB可通过经典途径和旁路途径被活化。LPS、TNF-a和IL-1β被IIK-β依赖的IKK激酶磷酸化，进而导致NF-κB的活化属经典途径；而LT-B、CD40L、BAFF和RANKL，通过IIK-A依赖的磷酸化导致NF-κB的活化属于旁路途径。肝细胞中IKK-B/NEMO基因敲除以及IKBa过度表达的小鼠模型中，细胞死亡加速、再生细胞的增生加强，倾向于恶性化进展，增加了肿瘤的易感性，提示肝实质细胞中的NF-κB有抑制肿瘤的作用，而巨噬细胞中NF-κB的活化是一种促肿瘤因子[85-87]。

STAT3是STAT家族的重要成员，是重要的核转录因子。STAT3可被JAK激酶、IL-6、EGFR、癌蛋白等激活，参与细胞的增殖、存活、凋亡、转化、免疫等生理病理过程。STAT3处于多条致癌信号通路的交汇点。JAK-STAT、PI3K-mTOR、Ras-Raf-MAPK等多条信号通路均涉及STAT3的信号传导[88]。研究[89]显示，IL-6基因敲除小鼠能减少STAT3的活化，不易经DEN诱导生成HCC。He等发现[90]，STAT3缺乏小鼠DEN诱导HCC的诱发率降低了6倍，且其生成的肿瘤体积相对较小，表明STAT3对肿瘤细胞的存活和增殖起重要作用；而STAT3和NF-κB信号通路抑制剂可以阻断肝癌细胞内TAM诱导的B7-H1的上调。

HIF-1是一种转录活化复合物，分为诱导型亚型(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)与组成型亚型(HIF-1β)。缺氧状态下，HIF-1α结合紧密，阻断了其翻译后的羟基化，引起蛋白酶复合体介导的凋亡；此外，缺氧还可以募集HIF-1α、HIF-1β以及共刺激因子。缺氧时，髓系巨噬细胞上调NF-κB，进而刺激HIF-1基因的转录[91]；而敲除IKKβ基因的小鼠，其肝细胞和KC中HIF-1的表达下调[86]。HIF-1信号通路对TAM的募集和活化起关键作用，并通过上调CXCR4/CXCR4L、CXCL12影响肿瘤细胞与基质的定位[92]。在低氧状态下，HIF-1还参与调控肿瘤的促血管生成机制[23]。

5 结论与展望

近年来，肿瘤微环境在HCC发病、复发和转移中的作用被广泛接受，分子靶向治疗理论的提出和临床应用为肿瘤内科治疗带来了革命性的变化。随着肿瘤基础研究的不断进展，越来越多的新型肿瘤靶向药物应用于临床，有效地提高了肿瘤患者的生存时间。

索拉非尼是晚期原发性肝癌的分子靶向药物。主要是通过阻断Raf/MEK/ERK通路介导的信号转导，同时抑制多种酪氨酸激酶，如VEGF-2、VEGF-3与PDGFR-β及与肿瘤生长相关的c-Kit等来达到抗肿瘤作用[93- 94]。但Rimassa等[95]的Ⅱ期临床试验发现，在放射治疗失败的进展性肝癌患者中，当索拉非尼剂量由400 mg/次、2次/d增加到600 mg/次、2次/d，患者的生存时间、生存质量都没有提高，说明增加索拉非尼剂量不能让进展期肝癌患者获益。

布立尼布是另一种有希望应用于肝癌治疗的靶向药物，它是小分子酪氨酸激酶抑制剂，主要通过抑制VEGF及FGF来治疗肿瘤[96-97]。2011年布立尼布作为一线治疗方案应用于晚期肝癌的Ⅱ期临床试验，初步结果证明该药安全能耐受，可用于晚期肝癌患者[98-99]。

除以上两种治疗HCC的靶向药物外，其他分子靶向药物也处于不同的临床研究阶段。TGF受体1激酶抑制剂LY2109761已被证实，在体外可以抑制HCC的迁移能力，在体内可以抑制肿瘤的生长、转移和侵袭[67]。其他激酶抑制剂的疗效与安全性测试尚处于Ⅲ期临床试验阶段，如brivanib(靶向VEGFR2和FGFR1)、linifanib(靶向PDGFR和VEGFR)、sunitinib(靶向PDGFR、VEGFR、c-Kit和Flt-3)、erlotinib(靶向EGFR)、PI-88(靶向乙酰肝素酶和硫酸酯酶)。此外，重组单克隆抗体VEGF(bevacizumab)、VEGFR2 (ramucirumab)和EGFR(cetuximab)的评估处于Ⅱ～Ⅲ期临床试验阶段。

HCC发生的细胞与分子机制还没有被了解，目前尚缺乏用于HCC早期诊断的分子标志物，其靶向治疗也仍面临诸多挑战。HCC微环境中，涉及细胞增殖、分化以及信号通路的分子都发生了改变。因此，新的抗HCC的疗法应该是靶向多种分子和通路的结合治疗，而不是单一的物质与单一通路。

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