一种低温α-淀粉酶的酶学性质研究

■闫祥洲 刘金爱 吴 勃 杜晓阳 陈敏杰 何俊佳

(1.河南省农业科学院，河南郑州450002；2.杭州保安康生物技术有限公司，浙江杭州311508）

淀粉是单胃动物能量的主要来源，其供能占总能量需求的60%～80%。幼龄动物消化系统发育不成熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。随着动物日粮配方的富营养化、饲养条件应激和环境污染问题越来越突出，成年健康动物添加“外源性营养消化酶”的作用也越来越明显，意义也越来越大。通过添加外源性淀粉酶来提高饲料淀粉的消化吸收，对于提高动物生产性能、节约饲料资源意义重大。

目前饲料专用淀粉酶的研究开发较少，一般均采用食品加工、化纤、印染等工业用酶。中温α-淀粉酶是饲料工业中应用最多的淀粉酶，其最适作用温度为70～80℃，pH值5.0以下失活严重。动物生理环境温度一般为37～42℃，胃内pH值较低，中温淀粉酶在动物消化道内发挥作用甚微。低温淀粉酶最适作用温度比中温淀粉酶要低20～30℃，因此，研究开发低温淀粉酶对饲料用酶而言具有重要意义。

饲用淀粉酶应具备以下几个条件：在动物体温（37～42℃）的温度条件下能发挥高的活性；最适pH值与消化道内食糜的pH相一致；对淀粉有高的酶解效率（内切酶）；具有良好的稳定性（在饲料高温制粒过程中的稳定性、保存过程中的稳定性以及在动物消化道中对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金属离子等的耐受性）[7]。本研究根据饲用α-淀粉酶的所需条件，对低温α-淀粉酶的酶学性质进行了研究，为饲料专用淀粉酶的开发提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌种

从采集到的样品中分离纯化并经诱变育种得到。

1.2 培养基

固体发酵培养基组成：麸皮50%、大豆粉25%、玉米粉15%、玉米芯7%、葡萄糖2%、酵母膏0.35%、Mg⁃SO40.04%、KH2PO40.1%、CaCl20.01%、NH4Cl 0.5%。

1.3 药品和试剂

1.3.1 0.05 mol硫代硫酸钠

将13 g Na2S2O3·5H2O和0.1 g无水碳酸钠溶解定容至1 000 ml。

1.3.2 费林试剂

铜溶液：硫酸铜34.66 g溶解在水中，定容至500 ml。

酒石酸钾钠碱溶液：酒石酸钾钠173 g和氢氧化钠50 g溶解在水中，定容至500 ml。

使用前，精确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。

1.3.3 1 mol/l乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH值5.0）

1 mol/l乙酸钠溶液：三水合乙酸钠溶解在水中，定容至250 ml；1 mol/l乙酸溶液：冰乙酸15 ml溶解在水中，定容至250 ml；将1 mol/l乙酸钠溶液加入到1 mol/l的乙酸溶液中，调pH值至5.0。

1.3.4 30%碘化钾溶液

将碘化钾150 g溶解于350 ml水中，保存在褐色试剂瓶中，避免阳光直射。

1.3.5 25%硫酸溶液

硫酸125 g溶于373 ml水中。

1.3.6 可溶性淀粉溶液（pH值5.0）

将可溶性淀粉（试剂级）在105℃干燥4 h后称量计算含水量。然后，根据可溶性淀粉的含水量称取0.5 g（折干）的可溶性淀粉，缓慢加入到50 ml水中，煮沸5 min，用自来水冷却后，加入1 mol/l乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH值5.0）5 ml，用水定容至100 ml。

1.4 低温淀粉酶活力的测定方法

将可溶性淀粉溶液加到100 ml Erlenmyer三角瓶中，置于（40±0.5）℃恒温水浴中。预热10～15 min，加入样品稀释酶液，准确加热30 min后。加入费林试剂使酶失活。将三角烧瓶直接在煤气喷灯（或电炉）上加热2 min后，立即放在自来水中冷却。随后，加入30%碘化钾溶液和25%硫酸溶液，用0.05 mol/l硫代硫酸钠溶液滴定游离出的碘，以蓝色消失作为滴定终点T30（ml）。

空白对照试验：以水取代酶液。在另一个三角烧瓶中用上述同样的操作步骤测定空白对照值T0，临近终点时，加入1%可溶性淀粉溶液1～2滴，以蓝色消失作为滴定终点。

酶活力单位定义为：1 g固体酶粉（或1 ml液体酶），于40℃、pH值5.0条件下，反应30 min，反应液中产生相当于10 mg葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活力单位。

式中：T30——酶反应液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(ml)；

T0——空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(ml)；

f——0.05 mol硫代硫酸钠溶液浓度的校正系数；

1.62——换算系数；

1/10——该分析方法的常数（相当于10 mg葡萄糖的还原糖）；

n——样品的稀释倍数。

2 试验结果

2.1 产酶菌株的发酵培养与活力检测

在固体发酵培养基中添加不同的碳、氮源及微量的无机盐，将经过筛选和育种得到的菌株接入固体发酵培养基中，30℃培养50 h。烘干、粉碎后测定低温淀粉酶活力，发现固体发酵培养基为麸皮50%、大豆粉25%、玉米粉15%、玉米芯7%、葡萄糖2%、酵母膏0.35%、MgSO40.04%、KH2PO40.1%、CaCl20.01%、NH4Cl 0.5%时，酶活高达3 820 U/g。

2.2 酶学性质的研究

2.2.1 低温α-淀粉酶作用温度的研究

在pH值5.0的酶活测定反应体系中，分别在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃温度下测定酶活，温度对酶活的影响如图1。

图1 温度对酶活的影响

由图1可知，该低温α-淀粉酶最适作用温度为50℃，在35～60℃之间均有较高的酶活。

2.2.2 低温α-淀粉酶的最适作用pH值

在40℃的酶活测定反应体系中，分别调节pH值为2.2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，测定结果如图2所示。

由图2可知，该低温淀粉酶最适作用pH值为5.2，在pH值4.0～6.0之间均有较高的酶活。

2.2.3 低温α-淀粉酶的热稳定性

为了准确评估低温淀粉酶经饲料高温制粒后的实际存留率，本试验在饲料中添加20%的低温α-淀粉酶，然后进行85℃高温制粒后进行评估，试验结果见图3。

图2 pH值对酶活的影响

图3 酶的热稳定性

由图3可知，制粒前低温α-淀粉酶理论值为624 U/g，实际检测值为603 U/g，经过85℃制粒后酶活为531 U/g，酶活存留率达到88.1%，说明在高温制粒过程中低温α-淀粉酶具有较好的耐受性能，适用于饲料制粒工艺。

2.2.4 低温α-淀粉酶的耐酸性评估

将制得的酶液分别用pH值3.5、4.0、4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液处理0、1、2、3、4 h，测定淀粉酶活力，结果如图4所示。

图4 低温淀粉酶的耐酸性

用pH值3.5的乙酸-乙酸钠缓冲液处理4 h后，淀粉酶活力存留80%以上，经pH值4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液处理4 h后，淀粉酶活力存留90%以上，说明该淀粉酶耐酸性良好。

2.2.5 体外模拟耐胃蛋白酶试验

模拟动物体内生理环境，在温度40℃条件下，加入1 mg/ml的新鲜胃蛋白酶盐溶液（0.1 N，pH值3.5），处理5 h，每隔1 h测定淀粉酶活，见图5。

由图5可知，在pH值3.5、温度40℃、用1 mg/ml的胃蛋白酶溶液处理淀粉酶5 h后，淀粉酶活力存留仍在80%以上。

图5 耐胃蛋白酶试验

2.2.6 HPLC对酶解产物的分析

取一定量5%的淀粉溶液，预热保温40℃，加入一定量的低温淀粉酶，控制反应时间为30 min，然后沸水浴5 min使酶失活，微孔膜过滤后，利用HPLC分析样品中各物质的分子量分布，图谱峰见图6。

图6 低温淀粉酶酶解产物HPLC图谱

从图6可以看出，低温淀粉酶酶解产物分子量多集中于5 000以下，占酶解物总量的70.26%。

3 结论与讨论

通过分离纯化筛选到的菌株，产淀粉酶活力能够达到3 820 U/g，同国内报道的低温淀粉酶菌株相比，具有较高的研究应用价值。该淀粉酶是一种内切型α-淀粉酶，最适反应温度为50℃，最适作用pH值为5.2，在pH值4.0～6.0之间具有较高活性；该低温淀粉酶有较好的耐酸性和耐热性，用pH值4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液处理4 h后，淀粉酶活力存留90%以上，经过85℃高温制粒后，酶活存留率为88.1%。采用体外模拟耐胃蛋白酶试验，证明胃蛋白酶对其无影响。

从酶学性质分析，该菌株生产的低温α-淀粉酶适合动物消化道环境条件，能够耐受高温制粒，在饲料行业有很大的应用前景。