小四五颗粒对糖尿病肾病大鼠血浆蛋白质图谱的影响

魏 敏，孙晓敏，罗 仁，柳志伟，郑雪花

(1福建中医药大学中西医结合学院，福州350122;2南方医科大学中医药学院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的并发症之一，是导致终末期肾病(ESRD)的主要病因［1］。临床上应用中药小四五颗粒治疗DN已取得良好疗效。2013年4～12月，我们对DN大鼠模型给予小四五颗粒，观察其血浆蛋白质图谱的变化差异，旨在从蛋白质分子水平阐明DN的发病机制及小四五颗粒治疗DN的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料 选用SPF级Wistar雄性大鼠24只，体质量200～280 g，鼠龄3个月左右，由南方医科大学动物实验中心供应。小四五颗粒剂(柴胡、黄芩、半夏、人参、白术、茯苓、泽泻、猪苓、桂枝、熟地黄、白芍、当归、川芎、甘草等)由南方医科大学中医药学院制剂室制成颗粒剂，临用前配成混悬液。硫代硫酸钠、无水碳酸钠、甲醛、硝酸银、乙醇、冰醋酸、醋酸钠、甘氨酸均为天津大茂化学试剂厂试剂，药物STA、血浆去高丰度蛋白试剂盒购自Sigma公司，等电聚焦仪、垂直电泳仪及其配件均为Bio-Rad公司配套仪器，图像分析软件为 Image Master 2D platinum 5.0。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制作 大鼠适应性喂养1周后，禁食12 h，随机分为模型组、治疗组、正常对照组各8只。模型组和治疗组腹腔注射65 mg/kg STZ，72 h后尾静脉取血测血糖，以血糖＞16.7 mmol/L为糖尿病模型成功，2周后测微量白蛋白、血糖，高于正常值者为DN造模成功。造模成功后，治疗组给予小四五颗粒1.8 g/kg(按照人与大鼠体表面积换算，相当于成人20 g/d)灌胃，模型组与正常对照组给予等体积生理盐水灌胃，均1次/d，连续4周。

1.2.2 蛋白定量检测 处死大鼠，腹主动脉取血，4℃离心10 min，取上层血浆，EP管 100 μL/管分装后，－80℃保存备用。采用Bradford法进行蛋白定量，取5、10、15、20、25、30、35 μg 的 BSA 制作标准曲线，样品取3 μL，双复管测定。每管加入1 mL Bradford染色，涡旋振荡20 s，充分混匀，测定吸光度值。

1.2.3 双向凝胶电泳检测 取100 μg蛋白样品与上样缓冲液充分混合，总体积460 μL，参考文献［2］和仪器操作手册进行等电聚焦、SDS-PAGE凝胶电泳，硝酸银染色，扫描凝胶图像，使用PD-Quest分析软件进行图像分析，其过程包括斑点检测、量化、背景消减和匹配，蛋白斑点的差异分析，选取表达量相差2倍以上为差异表达范围。

2 结果

2.1 蛋白定量检测结果 正常对照组、模型组、治疗组的血浆蛋白平均浓度分别为 4.87、4.79、4.80 μg/μL。

2.2 双向凝胶电泳检测结果 见图1。与正常对照组相比，模型组血浆蛋白质银染双向凝胶电泳图谱中高表达的蛋白质斑点54个，低表达的蛋白质斑点19个;治疗组血浆蛋白质银染双向凝胶电泳图谱中高表达的蛋白质斑点43个，低表达的蛋白质斑点14个，有16个较模型组明显恢复。

图1 双向凝胶电泳图谱

3 讨论

小四五颗粒由东汉张仲景《伤寒论》中的小柴胡汤、五苓散及宋代《太平惠民和济局方》中的四物汤三方组成，其中小柴胡汤疏通三焦、理气和解，五苓散通阳化气、利水渗湿，四物汤养血活血祛瘀，全方脾肾双补、攻补兼施、阴阳相济，可行气祛瘀、升清降浊。研究表明［3，4］，小四五颗粒具有与 ACEI相当的改善肾内血流动力学异常的作用，并可减少尿蛋白排泄，延缓慢性肾病的进程。我们的前期研究显示，小四五颗粒对DN大鼠模型具有防治作用，能够降低血脂和血糖，调节肾素—血管紧张素系统(RAS)基因表达，在一定程度上阻止肾小球硬化，延缓 DN 进展，并有一定的逆转作用［5～7］。

双向电泳由O'Farrell［8］最早建立于20世纪70年代，其基本原理为:第1向基于蛋白质的等电点不同在梯度胶内等电聚焦(IEF)，第2向则根据分子量大小运用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)不同进行分离，把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的核心技术，该技术广泛用于临床疾病的研究中［9～11］。肾病中的蛋白尿治疗非常棘手，其产生可能是由于一个或多个血浆因子渗透导致肾小球滤过膜通透性增高而致蛋白渗出。Candiano等［12］利用2-DE技术从FSGS小鼠血清中检测出50个蛋白质点，均能改变血清白蛋白通透性，其中对白蛋白通透性有抑制作用的5种蛋白质为高密度脂蛋白复合体、高分子量J与L，以及一个28 kD片段A-IV。上述研究提示，血浆中存在改变肾小球滤过膜通透性的因子，这可以阐明DN蛋白尿的发生机制。血浆取材容易、富含蛋白质，其蛋白水平的变化与多种疾病有关。观察血浆中蛋白质的改变情况，可为疾病的诊断、治疗和预后提供全面的信息。本实验通过建立DN大鼠模型，给予中药小四五颗粒干预，应用蛋白组学实验技术，从分子水平观察血浆蛋白质银染双向凝胶电泳图谱的变化。结果显示，与正常对照组相比，模型组电泳图谱中高表达的蛋白质斑点54个、低表达的蛋白质斑点19个、治疗组高表达的蛋白质斑点43个、低表达的蛋白质斑点14个，治疗组上述差异表达的蛋白质斑点有16个较模型组明显恢复。因此推测，16个差异表达的蛋白质斑点可能与DN的发生发展密切相关，在后续实验中，我们将进一步深入研究这些蛋白质斑点，明确相关的差异蛋白。

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