燕麦干草对藏羊尿中嘌呤衍生物、肌酐及马尿酸排出量的影响

刘 浩，周建伟，张 瑛，尚占环，米见对，龙瑞军＊

（1.兰州大学草地农业科技学院，兰州730000；2.兰州大学青藏高原生态系统管理国际中心，兰州730000；3.兰州大学生命科学学院，兰州730000）

藏羊（ovis aries）是我国三大原始绵羊品种之一，是藏族人民在特殊自然环境下长期选育而成的主要畜种［1］。青藏高原是全球海拔最高地区，素有“世界屋脊”之称［2］，具有年平均气温低（－1 ℃至－5℃）、牧草生长期极短（6月至9月）、牧草生物量季节变动大的特点［3］。藏羊独特的生物学特征和生理学机制，恰好适应青藏高原严酷的自然环境和传统粗放的管理方式［4］。据张瑛等［5］报道，与其他绵羊相比，藏羊具有较低的氮素维持需要量的特点，这可能是经过长期进化，藏羊与生活在同一环境的牦牛一样进化出了比其他低海拔反刍家畜更有效地利用饲粮中的氮以保证生存的特殊机制［6－10］，瘤胃微生物蛋白是反刍动物蛋白质的主要来源［11－12］，PD 法估测瘤胃微生物蛋白因其操作简单、准确而又非损害性的特点［13－14］，在20世纪80、90年代受到国外反刍动物学者的青睐。但PD 法估测瘤胃微生物蛋白的研究在我国起步较晚，相关研究相对较少［15］，尤其是关于藏羊尿中嘌呤衍生物排出量的研究未见报道。本试验通过研究燕麦干草不同限饲水平对藏羊尿中马尿酸、肌酐、PD 及其各组分排出量响应的影响，为估测藏羊瘤胃微生物蛋白产量及揭示氮代谢机制提供依据，为青藏高原藏羊的生产实践提供科学合理的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验地点

燕麦干草限饲及绝食试验在甘肃省天祝藏族自治县安远镇兰州大学青藏高原生态系统管理国际中心乌鞘岭实验站（北纬37°12.479′，东经102°51.695′，海拔3 154m）进行，后期样品分析于2013年2～6月在兰州大学青藏高原生态系统管理国际中心实验室进行。

1.2 试验概况

选取5头体重为（45±2）kg的20月龄、健康的去势公藏羊作为试验动物，为了更好地开展试验以及减少藏羊试验中的应激性，保证数据可靠性，在试验正式开始前，对藏羊进行为期20d的适应期，以便其熟悉生活环境、饲养人员及其他实验设施。

1.3 试验设计

本研究分为限饲试验和绝食试验两个阶段。首先开展限饲试验，分成4个试验期进行，每期为21 d，包括预试期15d和正试期6d。限饲期内，试验动物每天08∶00和18∶00各饲喂1次，自由饮水。待藏羊体况恢复后开展绝食试验，共18d，前10d为预试期，按藏羊维持水平饲喂饲粮600g／d（干物质，DM 基础），正试期8d，第1天饲喂量减至0.6倍维持水平，第2天减至0.3倍维持水平，第3～6d完全绝食，第7～8d分别恢复至0.3倍维持水平、0.6倍维持水平，绝食期间自由饮水。根据预试期确定45kg藏羊自由采食量（VI）为1000g／d，设置4个饲喂水平，分别为30%（304.28g，0.3VI组）、50%（505.96g，0.5VI 组）、70%VI（707.64g，0.7VI）、90%VI（912.85g，0.9VI组）。4×4 拉丁方试验设计（见表1）。

1.4 试验饲粮与饲养管理

试验饲粮为单一的燕麦青干草，用铡草机处理成长度1～2cm 以方便饲喂。饲粮营养物质含量（风干基础）：干物质（dry matter，DM）88.5%；有机物（organic matter，OM）82.9%；中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）含量53.1%；酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量39.8%；钙含量0.39%；磷含量0.18%。具体饲料组成和自由采食水平见表2。

表1 试验设计Table 1 Experiment design

表2 试验饲粮组成和自由采食水平（干物质基础）Table 2 Composition and daily intake level of the experimental diets（DM basis）

1.5 样品采集

限饲试验开始后的第16d，即正试期第1d的08∶00（饲喂前）开始采用全收粪尿法，连续收集5 d，并记录每天每头藏羊的排尿量、排粪量，将每天收集的尿样混匀，按总尿量的10%取样，用50%的硫酸溶液酸化，使pH＜3.0，以利于固定尿中NH3－N和避免微生物生长，并在－20 ℃的冰柜中保存，每期试验结束后，将5d的粪样制成混合样。

1.6 样品分析

藏羊尿液中嘌呤衍生物各组分、肌酐、马尿酸的排出量采用安捷伦LC1200 型高效液相色谱仪测定，方法参照李晓鹏等［16］HPLC法测定。

1.7 数据统计

所有试验数据用Excel 2010版软件进行整理、绘图；用SPSS17.0 进行One－way ANOVA 和双变量PEARSON 系数分析。

2 结果

2.1 嘌呤衍生物及肌酐、马尿酸排出量及占总PD比重

由表3知，尿中PD 包括尿囊素、尿酸、次黄嘌呤、黄嘌呤。随着限饲水平降低，尿中PD 各组分、马尿酸及总PD 排出量线性增加（P＜0.05），尿囊素在总PD 中所占比重也线性增加（P＜0.01），而尿酸、次黄嘌呤＋黄嘌呤在总PD 中所占比重线性减小（P＜0.01）；次黄嘌呤、黄嘌呤单独计算时数值较小且不方便，将次黄嘌呤＋黄嘌呤作为一个指标处理，PD 各组分占总PD 的比重分别为尿囊素66.6%～73.8%，次黄嘌呤＋黄嘌呤为13.5%～18.9%，尿酸为11.2%～14.4%，且随着限饲水平降低，尿囊素占总PD 比重升高，尿酸和次黄嘌呤＋黄嘌呤占总PD 比重均下降；当限饲水平超过0.5VI时，尿囊素比重差异不显著（P＞0.05），较高限饲水平的三组与0.3VI 组的尿囊素比重差异显著（P＜0.05）。

表3 燕麦干草不同限饲水平对尿中PD、肌酐、马尿酸排出量及PD 比重的影响Table 3 Effect of different restricted feeding levels of oat hay on urinary excretion of PD，creatinine，hippuric acid and percentage of PD

2.2 嘌呤衍生物各组分、总PD、肌酐、马尿酸之间相关性分析

由表4可知，嘌呤衍生物各组分与总PD 之间呈极显著性相关关系（P＜0.01），马尿酸与尿囊素、总PD 之间呈显著相关关系（P＜0.05），肌酐与PD各组分、总PD、马尿酸之间不相关（P＞0.05）。

表4 嘌呤衍生物各组分、总PD、肌酐、马尿酸之间相关性分析Table 4 Correlations among components of PD，total PD，creatinine and hippuric acid

2.3 可消化有机物采食量（DOMI）与尿中马尿酸、总PD 排出量的关系

由图1、图2可知，总PD 排出量（mmol／d）与可消化有机物采食量（DOMI，kg／d）线性相关（P＜0.05），其关系式为：总PD（mmol／d）＝14.066DOMI（kg／d）＋1.5262，（n＝20，R2＝0.9883）；马尿酸排出量（g／d）与可消化有机物采食量（DOMI，kg／d），其关系式为：马尿酸排出量（g／d）＝19.365DO－MI（kg／d）＋3.6437（n＝20，R2＝0.9666）。

2.4 绝食期内源嘌呤衍生物动态变化

由图3 可知，随着绝食时间的延长，尿中尿囊素、尿酸、次黄嘌呤＋黄嘌呤以及总PD 排出量均呈现先下降后趋于稳定的趋势，尿囊素动态变化与总PD 基本一致，绝食后第4～6d嘌呤衍生物排出量基本达到稳定水平且在第5d时排出量最低，据此可以计算出内源PD的每天排出量为1.95mmol／d。

图1 可消化有机物采食量与总PD 排出量关系Fig.1 The relationship between DOMI and excretion of total PD

图2 可消化有机物采食量与马尿酸排出量关系Fig.2 The relationship between DOMI and excretion of hippuric acid

图3 藏羊绝食期尿液PD 排出量Fig.3 Urinary PD excretion during the fasting period in Tibetan sheep

3 讨论

尿囊素是哺乳动物嘌呤代谢的终产物［17］。对反刍动物而言，尿中嘌呤衍生物来源于被宿主吸收的瘤胃微生物蛋白［18－19］及自身组织蛋白的嘌呤代谢，而后者所占的比重很小［11］。因此，Topps和Elliott推断［20］反刍动物尿中尿囊素的排出量与其瘤胃微生物之间具有某种关系，该假设后来在黄牛［21］、水牛［22］、牦牛［7，9］、绵羊［23］、山羊［24］上被证实并建立了有机物采食量与尿中嘌呤衍生物排出量的相关模型。

3.1 燕麦干草不同饲喂水平对藏羊尿中PD、肌酐、马尿酸排量的影响

3.1.1 嘌呤衍生物 本试验中，尿中PD 及各组分排出量随着限饲水平降低而增加，这与王永新等［25］和徐萍等［26］得出的结论一致。尿中PD 各组分排出量对各限饲水平的响应表明，尿中PD（主要为尿囊素）排出量对采食量非常敏感；当采食水平大于0.5VI时，藏羊尿中尿酸排出量相对稳定；而尿中黄嘌呤＋次黄嘌呤排出量对采食量的敏感性介于前两者之间。与Chen等［11］在绵羊上的结果相似，随着限饲水平的降低，尿中尿囊素在总PD 中的比重增加，而尿酸、黄嘌呤＋次黄嘌呤的降低。当饲喂水平大于0.3VI 时，尿中尿囊素比重相对稳定，在71.38%～73.82%之间；当饲喂水平大于0.3VI时，尿中黄嘌呤＋次黄嘌呤比重相对稳定，在13.5%～15.02%之间；当饲喂水平小于0.9VI时，尿中尿酸比重相对稳定，在12.80%～14.39%之间。反刍动物尿中PD 的主要成分是尿囊素，其次为尿酸，最后是黄嘌呤＋次黄嘌呤［27－28］，本试验藏羊尿中PD尿囊素含量低于黄牛［21］、牦牛［7，9］、及绵羊［29］上的研究结果，但Chen等［30］在绵羊中得出的结果相近。据报道，黄牛尿液PD 中黄嘌呤＋次黄嘌呤含量相对较低，基本可以忽略不计［28］，Chen等［30］测得绵羊尿液PD 中黄嘌呤＋次黄嘌呤含量在10.15%～15.00%之间，略低于本试验研究结果。因此，藏羊尿液PD 中相对较高的黄嘌呤＋次黄嘌呤含量和相对较低的尿囊素含量，可能是由于其体内血液、肝脏和肠道粘膜细胞中较低黄嘌呤氧化酶活性，致使藏羊体内次黄嘌呤、黄嘌呤没有完全转化成尿囊素。

3.1.2 肌酐 肌酐是肌酸和磷酸肌酸代谢的终产物，它主要由肌肉中磷酸肌酸的非酶促反应生成，再释放到血液中，随尿排泄。反刍动物尿中肌酐排出量与体重［31］、肌肉含量［32］、品种及生理期［9］等因素有关，而不受饲粮的影响，即使在代谢体重基础上，体重较大的动物尿中排出肌酐多［33］。本试验同样表明尿中肌酐排出量不受日粮的影响，因此肌酐通常作为一种稳定的内标物来测定肾小球率过滤，Chen等［34］报道绵羊尿中肌酐排出量的均值为0.46 mmol／（kg BW0.75·d），Hovell等［35］报道绵羊尿中肌酐排出量为0.43～0.47mmol／（kg BW0.75·d），杨膺白等［36］在对波尔山羊研究时测出肌酐量为0.46～0.48mmol／（kg BW0.75·d），本试验中藏羊在不同限饲水平下尿中肌酐排出量的范围为0.40～0.42mmol／（kg BW0.75·d），与上述结果相近。

3.1.3 马尿酸 马尿酸是苯甲酸和甘氨酸在肝脏中结合的产物，对防治草食动物苯甲酸中毒具有重要意义［37］。本研究中，随着限饲水平升降低，藏羊尿中马尿酸排出量线性增加，表明马尿酸排出量与饲粮摄入量有关，目前对于马尿酸的研究及应用较少，仅在牛奶受尿液污染方面有过报道［38］。

3.2 嘌呤衍生物各组分、总PD、肌酐、马尿酸的相关性研究

反刍动物体内的核酸和嘌呤底物在核苷磷酸化酶的作用下降解为黄嘌呤和次黄嘌呤，再被黄嘌呤氧化酶降解为尿酸，然后进一步降解为尿囊素［11］，由此可见，尿中PD 及各组分之间可能存在某种相关关系，本试验中尿囊素、尿酸、次黄嘌呤＋黄嘌呤、总PD 四个指标两两之间存在正相关关系也恰好验证了这一观点。马尿酸和尿中PD 及尿囊素呈正相关，因此，通过建立某种模型，只要测得其中一个指标即可以推测另外两个指标的数据，使工作量大大减小。尿中马尿酸、PD 及其组分均受日粮水平的影响，而尿中肌酐不受日粮影响，因此，肌酐与马尿酸、PD 及其组分不相关。

3.3 可消化有机物采食量（DOMI）与总PD、马尿酸排出量的关系

采食量是影响动物尿中PD，马尿酸排出量的重。尿中PD 排出量随DOMI 的增加而线性增加［7，9，39］，本试验中，总PD 排出量（mmol／d）与可消化有机物采食量（DOMI，kg／d）的关系式为：总PD（mmol／d）＝14.066DOMI（kg／d）＋1.5262，（n＝20，R2＝0.9883）。当DOMI＝0 时，PD＝1.53 mmol／d［即0.09mmol／（kg BW0.75·d）］，该值可用于內源嘌呤衍生物排出量的估测；马尿酸排出量与DOMI具有很好的相关性，其关系式为马尿酸排出量（g／d）＝19.365DOMI＋3.6437（n＝20，R2＝0.9592），其在测定采食量及预测尿中PD 排出量等方面都有潜在的应用价值，有待深入研究。

3.4 绝食期藏羊内源PD

本试验测得藏羊内源PD 排出量为1.95 mmol／d［即0.11mmol／（kg BW0.75·d）］，与通过尿中PD 和DOMI所建立模型估测值接近。据Chen等［30］报道绵羊平均每天排出内源PD 为0.15 mmol／（kg BW0.75·d），Lindberg［40］报道山羊内源PD 排出量为0.19mmol／（kg BW0.75·d），Soejono等［41］报道黄牛每天排出内源PD 为0.13～0.14 mmol／（kg BW0.75·d），而藏羊内源PD 排出量均低于上述所选动物，可能是藏羊与生活在同一生境的牦牛一样，进化出了特殊的肾脏调控机制［42］，以适应青藏高原牧草长期匮乏的现状。

4 结论

限饲水平与马尿酸、PD 及各组分排出量呈负相关，但与肌酐排出量无相关性；利用PD 与DOMI建立的模型估测出内源PD 排出量与内源PD 实际排出量接近，验证了模型的准确性。

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