刺五加体细胞胚发生过程中几丁质酶和葡聚糖酶活性变化

胡 盈，赵晓妮，孙凤阳，刘弈佳，陶 雷，卢 宏，由香玲

(东北林业大学 a.生命科学学院；b.园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

刺五加Eleutherococcus senticosusMaxim.为五加科五加属落叶灌木，别名刺拐棒、刺老芽等。具有抗疲劳、抗衰老，提高免疫力，保护心血管等作用，是十分珍贵的药物资源。关于其药用成分的研究已有很多报道[1-2]。近年来，由于刺五加野生资源匮乏，加之其有性繁殖周期较长，自然

在通过质壁处理刺五加合子胚诱导体细胞胚的发生过程中发现：胼胝质(主要成分为β-1,3-葡聚糖)与体细胞胚发生呈现一定的相关性[19-21]。而体细胞胚发生也是植物体适应外界胁迫因子产生的一种响应。目前还未见普遍存在于高等植物细胞内的2类防御因子——β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶[22]在刺五加体细胞胚发生过程中的变化规律的相关报道，这正是本文要探讨的问题，旨在为刺五加体细胞胚的发生机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 刺五加体细胞胚发生及取材

在前期试验中获得了刺五加胚性愈伤组织，掌握了体细胞胚发生发育过程[17]。本试验是在前期研究的基础上进行的。首先将胚性愈伤组织(见图1A)在增殖培养基(MS＋1.0mg/L 2,4-D)培养，每20d继代1次，进行快速增殖。然后接种到不添加任何激素的MS固体培养基上诱导体细胞胚发生、发育。从培养2周开始，形成球形体细胞胚(见图1B)后，依次经历心型、鱼雷、到第5周发育为成熟的子叶体细胞胚(见图1C)。

图1 刺五加体细胞胚发生过程Fig.1 Generating process of somatic embryogenesis in Eleutherococcus senticosus

取增殖培养4周后的胚性愈伤组织，设为对照，接种于未添加任何激素的3％蔗糖MS培养基上，光照培养，每7d取1次样，每次取8瓶，并将材料按0.3、0.1g分别称4份，用液氮冷冻保存于-80℃的冰柜中，分别用于测定几丁质酶活性和胼胝质含量。另取4份各0.5g材料，立刻进行β-1,3-葡聚糖酶的提取，后冻藏保存，用于分析其酶活性。连续取样35d。

1.2 几丁质酶活性的测定

1.2.1 几丁质粗酶液的提取

取冷冻保存的材料(0.3g)放入预冷的研钵中，加液氮迅速研磨成粉末后，加2.0mL醋酸提取液(0.05 mol/L，pH 5.0)和少量的石英砂，转入2mL离心管，迅速于4℃下12 000r/min离心15min，上清液转移到新的1.5mL离心管中，4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 N-乙酰葡萄糖胺标准曲线的制备

首先配制100μg/mL N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)母液。分别取9支5mL试管编号1～9号。将配制的质量浓度为 0.0、12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0、87.5、100.0μg/mL的N-乙酰葡萄糖胺分别转入有编号的试管，然后分别加入0.2mL饱和硼砂溶液，沸水浴7min，迅速冷却后，加2mL冰醋酸、1mL 1％ DMAB，37℃水浴保温15min后，溶液呈红色，于585nm波长处，从低质量浓度到高质量浓度测定上述反应液的吸光值，试验重复3次。取其均值制作标准曲线为：y＝0.008 2x-0.015 9(R2＝0.998 8)。

1.2.3 外切几丁质酶活性的测定

主要参考Reissig等的方法[23]对外切几丁质酶活性进行测定。依次取0.4mL粗酶提取液、0.4mL醋酸缓冲液(0.05 mol/L，pH 5.0)和0.4mL胶体几丁质溶液(1％)于试管中。37℃水浴反应2h后，4 000r/min离心10min。取0.4mL上清液，加0.2mL饱和硼砂溶液(上清液即刻变黄色)，沸水浴7min，冷却后再加2mL冰醋酸和1mL 1％对二甲氨基苯甲醛溶液，立刻于37℃水浴保温15min后，溶液呈红色，于585nm波长处测定溶液吸光值，试验重复3次。根据上述建立的标准曲线，计算酶活性。

1.2.4 内切几丁质酶活性的测定

取0.4mL上述上清液，加40μL 1％蜗牛酶溶液，继续在37℃反应30min，用上述Reissig等的方法[23]测定产生的N-乙酰葡萄糖胺量，即得总几丁质酶活性。总几丁质酶活性减去外切几丁质酶活性，即为内切几丁质酶活性。1个酶活性单位(U)定义为每克鲜植物组织每小时分解胶体几丁质产生1.0μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量。

1.3 β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性的测定

1.3.1 β-1,3-葡聚糖含量的测定

取冷冻保存的材料(0.1g)，用液氮快速研磨成粉末后，用1.0mL 20％乙醇冲洗3次，10 000r/min离心5min，弃上清，除去材料上的荧光。在样品中加入1.0mL 1.0 mol/L NaOH，80℃水浴15min，以增加胼胝质的溶解，再10 000r/min离心15min之后，取上清液0.2mL依次加入0.4mL 0.1％苯胺蓝、0.21mL 1 mol/L HCl、0.59mL 1 mol/L甘氨酸–氢氧化钠(Gly-NaOH)缓冲液，振荡器上振荡混匀，50℃水浴20min，室温30min直至苯胺蓝变为无色。空白对照用0.4mL蒸馏水代替苯胺蓝，最后用荧光分光光度计测含量(激发光400nm和发射光510nm、激发狭缝5nm、发射狭缝5nm、平均时间0.100 00s)。

以茯苓聚糖(Fluki，Buchs,Switzerlands)作对照品，试验重复3次，取平均值用外标标准曲线法定量，回归方程为y＝0.366 4x-0.724 9(R2＝0.995 1)，标准曲线在2～10μg之间为线性。

1.3.2 β-1,3-葡聚糖酶活性的测定

β-1,3-葡聚糖酶的提取和活性测定参照史益敏的方法[25]。称取鲜质量0.5g材料，放入预冷的研钵中，加3.0mL 0.05 mol/L的醋酸钠缓冲液(pH 5.0)和0.05g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在冰浴中充分研磨，4℃的环境下15 000×g离心15min，取上清液在10 000×g下离心10min，所得上清液即为粗酶液，放于冰箱备用。取1.0mg/mL的昆布多糖，溶于0.4mL上述醋酸钠缓冲液，加入0.1mL酶液，于37℃保温15min，立即加入0.5mL铜试剂，混匀，并于100℃水浴10min，置冷水中冷却，再加入0.5mL砷钼酸试剂，呈现蓝色后加蒸馏水3.5mL，摇匀，660nm波长的光下比色，对照标准曲线求出样品液的还原糖含量。以1.0 nmol/(g·s)为1个酶活性单位(U)。

2 结果与分析

2.1 体细胞胚发生过程中几丁质酶活性的变化

几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成分，植物中不存在；但几丁质酶广泛存在于自然界，在高等植物中也较为普遍。各种植物、动物及微生物细胞和组织中的几丁质酶可将几丁质水解为寡聚糖，再进一步水解为N-酰氨基葡萄糖[25]。按照Yeboah等的建议，根据水解几丁质切口位置的不同，将几丁质酶分为内切几丁质酶和外切几丁质酶；根据酸碱性，分为酸性几丁质酶和碱性几丁质酶[26]。

在体细胞胚发生过程中，几丁质酶活性的变化如图2所示。由图2可见，外切和内切几丁质酶活性在体细胞胚发生过程中均有显著变化。从图2中可以看出，0～14天期间，即球形胚形成时期，活性逐渐增大，到第14天时，外切几丁质酶活性达到了最大值94.45μg·g-1h-1，是胚性愈伤组织时期的1.61倍；在体细胞胚发育过程中，随着培养时间的增加，外切几丁质酶活性呈下降趋势，但均显著高于对照；到第35天时，即子叶胚时期，外切几丁质酶活性达到最低，显著低于体胚发育的其它时期(P＜0.05)。

从图2中可以看出，在体细胞胚发生过程中，内切几丁质酶活性均高于胚性愈伤组织；整体呈上升趋势，到第35天，即在子叶胚期内切几丁质酶活性达到最高，为101.15μg·g-1h-1，是对照的3.76倍(P＜0.05)。

从胚性愈伤组织到成熟子叶期体胚，2种几丁质酶活性的变化规律完全不同。外切几丁质酶从胚性细胞到球形期，有显著的变化，其在体细胞胚发育过程中起重要的调控作用。类似的在胡萝卜温度敏感型细胞变异系ts11中，如果加入一种来自野生型胡萝卜细胞系的32 kDa酸性几丁质酶后，该变异系ts11能在非适宜温度下越过球形胚继续发育，如果不加这种几丁质酶，细胞系变异系ts11在非适宜温度下则无法越过球形胚时期[27]。这种32 kDa酸性几丁质酶在鸭茅体细胞胚发育的全过程中均被检测到[26]。刺五加体细胞胚发育过程中，外切几丁质酶的特性、作用还需进一步研究。

上述结果中内切几丁质酶的这种持续增长的变化趋势，可能与体细胞胚生长发育过程中外植体持续生长、需持续克服外界的各种光照、温度等培养环境的胁迫引起。其确切原因需要进一步研究。

图2 体细胞胚发生过程中几丁质酶活性的变化Fig.2 Changes of chitinase activities during somatic embryogenesis

2.2 体细胞胚发生过程中β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性的变化

从胚性愈伤组织到成熟子叶胚时期，β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性变化如图3所示。由图3可见，在体细胞胚发生过程中，第0～14天，即球形体胚形成过程中，β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性均呈上升趋势，在第14天达到最高，β-1,3-葡聚糖含量为61.43μg·g-1，是胚性愈伤组织中含量(21.89μg·g-1)的2.81倍；β-1,3-葡聚糖酶活性为40.23 U·g-1，是胚性愈伤组织中酶活性(15.92 U·g-1)的2.53倍；而后，在第28天和第35天，即体胚发育成熟时期，β-1,3-葡聚含量及其酶活性急速下降；β-1,3-葡聚含量与胚性愈伤组织的差异不显著(见图3)，但酶活性显著低于胚性愈伤组织(见图3)(P＜0.05)。

图3 体胚发生过程中β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性的变化Fig.3 Changes of the β-1,3-glucan content and β-1,3-glucanase activity during somatic embryogenesis

β-1,3-葡聚糖含量变化与其酶活性的变化较一致，只是在体细胞胚成熟期存在差异。在球形胚时期，β-1,3-葡聚糖含量与其酶活性均较高。在前期研究刺五加直接体细胞胚发生过程中，发现胼胝质含量在整个体细胞胚诱导过程中发生了规律性变化，认为胼胝质即葡聚糖的大量合成是刺五加体细胞胚发生的必要条件[21]。在其它植物的体胚诱导过程中，也发现过类似的β-1,3-葡聚糖含量升高的现象。例如，在诱导菊苣体细胞胚过程中，研究者发现，叶片为外植体，培养6d时，一些表皮细胞和小表皮细胞的内壁周围出现了大量的胼胝质，并且一直持续到大约150μm的原胚细胞团形成时才消失[29]。还有，山茶12周叶龄的叶片为外植体诱导体细胞胚时，在培养3～10d时发现有胼胝质形成[30]。椰子的体胚诱导过程中产生了胼胝质的沉积[31]，即大量β-1,3-葡聚糖大量合成。研究者普遍认为这种现象产生的原因是β-1,3-葡聚糖产生生理隔离，阻断了细胞间信息交流。

体细胞胚发生过程中β-1,3-葡聚糖酶活性变化及其作用，在诱导菊苣体细胞胚发生过程中有报道。研究者在菊苣体细胞胚发生过程中，监测并确认了1种胞外38kD β-1,3-葡聚糖酶，该酶在胚性感受态或侧期是稳定的，在表达期该酶活性显著增加，研究者从而推测该酶是体细胞从感受态向形态建成转变的信使分子[32]。而本研究中刺五加胚性细胞也是在形态建成期，即球形胚形成期，β-1,3-葡聚糖酶活性显著增加，但其特性需进一步研究。

3 结论与讨论

刺五加从胚性愈伤组织到成熟子叶体细胞胚发生过程中，几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶2种防御性酶的活性均有显著的变化。外切几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性均在球形体细胞胚形成过程中有显著的增高，而后随体细胞胚的进一步发育，均急剧下降，直到成熟子叶体细胞胚。相应的β-1,3-葡聚糖含量也是在球形体细胞形成期大量合成。由此可知，这2种防御性酶活性对体细胞胚的形态建成起重要作用。而内切几丁质酶在整个体细胞胚发生、发育过程中均是持续增加的，该酶可能对体细胞胚发生不起主要作用。

在植物抗病菌方面，几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶作用往往是协同增效的[33]。例如，单独的大豆中的几丁质酶对大豆疫霉菌的抑制作用不明显，单独的β-1，3-葡聚糖酶及其与几丁质酶混合，对大豆抗疫霉菌的抑制作用显著[22]。在刺五加体细胞胚发生过程中，活性变化趋势相对一致的外切几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的作用关系有待进一步研究。

植物的体细胞胚发生是一个多因素事件，受各种内因和外因的作用。合适的外植体在适当的外界胁迫因素作用下诱导体细胞胚发生。本试验中，该过程中的β-1,3-葡聚糖及其酶和外切几丁质酶均对体细胞胚发生的关键时期——球形胚有重要的调控作用。葡聚糖可能主要对细胞起生理隔离作用，而β-1,3-葡聚糖酶和外切几丁质酶可能均是体细胞胚形态建成的重要胞外信号因子。

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