杜仲EuHMGS基因鉴定及生物信息学分析

王 淋，乌云塔娜，叶生晶

(1.中南林业科技大学 a.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；b.林学院，湖南 长沙 410004；2.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；3.国家林业局杜仲工程技术研究中心，河南 郑州450003；4.国家林业局中南林业调查规划设计院，湖南 长沙 410014)

我国是世界上最大的橡胶消费国，橡胶被广泛应用于工业、航空及军事等高科技领域[1]。我国对国外橡胶的需求量较大，而我国特有的经济物种杜仲是名贵的药材，已被收录于2010 版中国药典[2]。不仅如此，杜仲果实、叶片、树皮、根部均含优质天然橡胶——杜仲胶[3]，其中杜仲叶含胶量为1％～3％，果实含胶量为10％～12％，是世界上极具发展潜力的优质天然胶资源[4]。杜仲果实的含胶量较高，利用杜仲果皮提取杜仲胶，可以降低杜仲胶提取的生产成本，促进杜仲胶产业的发展[5]。杜仲胶作为多萜类化合物，其结构与三叶橡胶顺式异戊二烯不同，杜仲胶为反式异戊二烯，这就决定了杜仲胶具有独特的橡塑二重性，被誉为高分子合金[6-7]。

萜类物质合成主要通过以下2条途径：一是Michel Rohmer和Duilio Arigoni等[8-9]提出位于质体的2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径(MEP)，二是Lynen等[10-11]提出位于细胞质的甲羟戊酸途径(MVA)，其中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase，HMGS)是位于MVA 途径中的一个重要的代谢酶，乙酰乙酰CoA(acetoacetyl-CoA)经羟甲基戊二酰CoA合酶(HMGS)的催化形成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)，随后在HMGCoA还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR)的作用下生成甲羟戊酸(MVA)，甲羟戊酸经焦磷酸化和脱羧作用形成异戊烯焦磷酸IPP，从而为杜仲胶的生物合成提供通用前体[12-13]。

目前，已经从动物和植物的MVA途径中系统分离出来HMGS基因进行了研究[14]，而本文中利用生物信息学技术，对杜仲胶生物合成的重要靶点之一的HMGS基因进行相关的预测及分析，旨在为利用基因工程技术代谢调控杜仲胶生物合成提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

玉米Zea mays、拟南芥Arabidopsis thaliana、葡萄Viteus vitifoliae、小立碗藓Physcomitrella patens基因组以及编码区序列来源于phytozome(http://www.phytozome.net/search.php)数据库，杜仲Eucommia ulmoidesOliv.数据来源于杜仲全基因组测序以及转录组数据[15-16]。

1.2 分析方法

利用生物信息学软件ExPASyProtParam、TMHMM对EuHMGS基因氨基酸残基数、氨基酸组成、蛋白质相对分子质量、理论等电点、蛋白质的亲疏水性等性质以及蛋白的结果保守域进行了预测与分析；利用PSIPRED、Swiss model预测蛋白质的二级、三级结构；利用软件GSDS对EuHMGS基因组结构进行预测；利用PLANT CARE在线软件预测EuHMGS基因启动子序列中可能存在的顺式元件进行分析。

2 结果与分析

2.1 HMGS基因序列分析

杜仲EuHMGS基因氨基酸序列与拟南芥Arabidopsis thaliana、葡萄Viteus vitifoliaeHMGS基因家族的基因序列相比较，存在多个保守区，序列相似性达到80 ％以上(见图1)，因此命名为EuHMGS，记为EuHMGS4[17]。

图1 全长HMGS蛋白多序列对比Fig.1 Multiple sequence alignment of the full length HMGS proteins

2.2 HMGS基因家族聚类分析

利用MEGA5.1软件对单子叶植物玉米Zea mays、双子叶植物拟南芥Arabidopsis thaliana、葡萄Viteus vitifoliae、苔藓类小立碗藓Physcomitrella patens的HMGS基因家族进行进化分析，构建了杜仲HMGS的系统进化树(见图2)。从系统进化树图中可知，单子叶植物玉米，双子叶植物杜仲、拟南芥、葡萄，苔藓类小立碗藓共分为3个主要的大分支，符合传统的进化分类结果。其中EuHMGS位于双子叶植物的1个大分支，且与VvHMGS2的遗传距离相对较近，说明EuHMGS4与VvHMGS2的同源关系较近。

图2 HMGRS蛋白的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of HMGRS proteins

2.3 HMGS基因家族的蛋白质理化性质分析

对各个植物HMGRS基因家族的蛋白质理化性质进行了预测，结果如表1所示。HMGRS基因编码氨基酸为450～470 aa；相对分子质量为50～52kD；理论等电点为5～6，不同植物的HMGS基因编码氨基酸数、相对分子质量以及理论等电点均较为一致。EuHMGS4、VvHMGS1为不稳定的疏水蛋白；ZmHMGS3为不稳定的亲水蛋白；AtHMGS为稳定的疏水蛋白；VvHMGS2、PpHMGS1、PpHMGS2、ZmHMGS1、ZmHMGS2为稳定的亲水蛋白。

表1 HMGS编码蛋白质的基本理化参数Table 1 Physical and chemical parmeters of HMGS

HMGS蛋白质的氨基酸组成如表2所示。由表2可见，HMGS基因所编码蛋白质的氨基酸组成大致相同，其中EuHMGS4中性疏水性氨基酸 为 Asn(N)3.3％、Ala(A)8.2％、Ile(I)4.6％、Leu(L)7.7％、Met(M)3.5％、Phe(F)4.9％、Val(V)6.0％、Trp(W)0.4％、Tyr(Y)5.3％，共43.8％；中性亲水性氨基酸为Asn(N)3.3％、Cys(C)2.2％、Gln(Q)3.5％、Gly(G)6.4％、Ser(S)9.7％、Thr(T)6.2％，共31.3％；碱性氨基酸为Arg(R)3.3％、His(H)2.0％、Lys(K)7.1％，共10.4％；酸性氨基酸为Asp(D)5.3％、Glu(E)6.2％，共11.5％。

表2 HMGS蛋白质的氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of HMGS ％

2.4 EuHMGS基因蛋白结构保守域预测

利用MEME在线工具分析HMGRS氨基酸序列的功能结构域(见图3)，无论是单子叶植物、双子叶植物还是苔藓类植物，HMGRS蛋白的结构保守域均为3个，且3个保守区均靠近蛋白的N端，其中Motif1起始位点为9 aa，保守序列为 ILAMEI YFPPTCVQQEAMETHDGVSKGKYTIGLGQDCM AFCTEVEDVISM；Motif2起始位点为72 aa，保守序列为IDPTQIGRMEVGSETVIDKSKSIKTFLMQI FEECGNTDIEGVDSTNACYG；Motif3起始位点为128 aa，保守序列为NCTNWVESSSWDGRYGLVV CTDSAVYAEGPARPTGGAAAIAMLIGPDAPI。

图3 HMGS基因的保守结构域Fig.3 The conserved domains in HMGS gene

2.5 EuHMGS基因的蛋白质基因跨膜结构域的预测

利用在线工具TMHMM2.0对EuHMGS4氨基酸序列的跨膜结构域进行预测(见图4)。EuHMGS4蛋白无明显跨膜区，蛋白全部位于膜外。

2.6 EuHMGS4蛋白的二级结构的预测

根据EuHMGS4氨基酸序列，预测其蛋白的二级结构(见图5)。结果表明，EuHMGS4蛋白二级结构中α-螺旋占38.05 ％，β-折叠占12.17 ％，螺环结构占49.78 ％，属于混合型结构的蛋白质。

图4 EuHMGS4蛋白的跨膜区预测Fig.4 Predicted transmembrane region of the deduced protein of EuHMGS4 protein

图5 EuHMGS4蛋白二级结构预测Fig.5 Predicted secondary structure of the deduced EuHMGS4 protein

2.7 EuHMGS蛋白的三级结构的预测

采用Auto mode建模方式对EuHMGS4蛋白进行同源建模，得到了EuHMGS4蛋白的三维空间模型，如图6所示。ExPAsy structure assessment程序评测推导的EuHMGS4蛋白模型QMEAN 6 得分为0.7。

2.8 EuHMGS基因的内含子和外显子预测及分析

将杜仲HMGS基因组序列及其对应的完整编码序列(coding sequence CDS)提交到GSDS在线网站预测基因组序列特征，结果如图7和表3所示。EuHMGS基因家族不同的基因具有不同的外显子和内含子数量，其中EuHMGS4有11个外显子，10个内含子，其中位于0相位的内含子6个，1相位的内含子1个，2相位的内含子3个。

图6 EuHMGS4蛋白三级结构预测Fig.6 Predicted tertiary structure of the deduced EuHMGS4 protein

图7 EuHMGS基因内含子和外显子预测Fig.7 Prediction on the intron and exon in EuHMGS

表3 EuHMGS4外显子和内含子分布序列Table 3 Distribution sequence on the intron and exon in EuHMGS4 bp

2.9 EuHMGS4基因启动子的顺式元件作用分析

利用PLACE 和plantCARE 在线数据库，预测EuHMGS基因启动子(5’UTR 2 000bp)的主要顺式元件潜在的分布以及功能(见表4)。结果发现，EuHMGS基因启动子含有大量基本顺式作用元件TATAbox、CAATbox，除此之外，EuHMGS4启动子部分还还有热胁迫(HSE)、脱落酸(ABRE)、水杨酸(TCA-element)、乙烯(ERE)等相关调控元件，这些顺式作用元件均可能参与杜仲MK基因功能以及萜类物质代谢调控的过程。

表4 EuHMGS4基因启动子区顺式元件作用预测Table 4 Function prediction on the cis-elements of promoter in EuHMGS4

续表1Table 1 Continuation

3 结论与讨论

杜仲羟甲基戊二酰辅酶A 合酶基因(EuHMGS)是甲羟戊酸途径(MVA)中的第1个催化酶，催化乙酰乙酰CoA 生成羟甲基戊二酰CoA，对于杜仲胶-多萜类的生物合成起着十分重要的作用[18]。序列上高度保守且功能相似的基因被称为是同一个基因家族，生理功能的实现一般是通过一个家族的功能来实现，而不是单独的1个基因，利用基因组数据，从基因家族的角度分析代谢途径以及基因的功能具有重要的意义[19]，根据杜仲HMGS的完整编码框(CDS)，在杜仲基因组数据中找到唯一1个HMGS基因，目前认为杜仲HMGS家族就只包含1个基因，而巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)HMGS也是一个小的基因家族，包括HMGS1和HMGS2[17]。对EuHMGS基因进行生物信息学分析结果表明，含有HMGS蛋白的典型保守序列GNTDIEGVDSTNACYGGTA；聚类分析显示EuHMGS与双子叶植物遗传距离较近，符合遗传进化规律。EuHMGS基因启动子中含有大量的脱落酸、水杨酸、茉莉酸响应调控元件。用甲基茉莉酸和水杨酸诱导CaHMGS 喜树子叶和胚轴中的表达，结果发现在不同的组织中具有不同的表达调控模式[20]，因此，推测EuHMGS基因也可能具有组织特异性表达基因，而且在巴西橡胶树中HMGS基因的mRNA和酶的活性在白天显著高于夜间，推测HMGS可能因含有大量的光调控顺式作用元件，导致HMGS基因的表达受到光变化的调控[21]。

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