响应面法优化物理辅助碱法提取米糠蛋白工艺

许 凤，王长远,2,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

响应面法优化物理辅助碱法提取米糠蛋白工艺

许 凤1，王长远1,2,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

比较分析碱法、胶体磨辅助碱法、超声辅助碱法、胶体磨超声辅助碱法对米糠蛋白提取率及纯度的影响。结果表明，胶体磨超声辅助碱法能够显著提高米糠蛋白的提取率，其纯度为74.27%。并以此方法中的超声功率、液料比、超声温度、超声时间为考察因素，蛋白提取率为响应值。通过Design Expert 8.0.6软件做响应面优化分析得，胶体磨超声提取米糠蛋白的最佳工艺为米糠粒径40目、pH 9、超声功率69 W、工作时间4 s、间歇时间2 s、液料比20∶1（mL/g）、超声时间40 min、超声温度46 ℃，此条件下模型预测蛋白提取率为92.14%。经验证，实际提取率为90.84%，与模型相符。胶体磨超声辅助碱法能够显著地提高米糠蛋白的提取率，且时间短，为米糠蛋白的进一步研究提供参考。

米糠蛋白；物理辅助碱法；提取率；响应面分析

目前，许多学者将不同来源的植物蛋白添加到食品中，以较低的成本来提高食品的营养价值[1-3]。米糠是碾米过程中的副产品，含12%～15%的粗蛋白[4]，蛋白质的消化率大于90%，氨基酸模式优于大豆蛋白和酪蛋白，含有丰富的赖氨酸（3%～4%），并且具有低过敏性，特别适合开发婴幼儿配方食品[5]。

但由于米糠蛋白的高聚合活性和蛋白中含有的二硫键使米糠蛋白的溶解性较差。此外米糠蛋白中含有肌醇六磷酸和纤维与蛋白质聚合，使米糠蛋白的分离较困难[6]。目前，提取米糠蛋白的方法主要有碱法提取、酶法提取和物理法提取。碱法提取时蛋白质暴露在强碱条件可能改变其营养特性，如半胱氨酸和丝氨酸残基转变成有毒性的赖氨酸和丙氨酸[7]；目前使用最多的是酶法提取，以蛋白酶为主，要保持米糠蛋白的良好营养性和功能性，需控制较低的水解度，而水解度低，又往往没有高的提取率[8]。并且蛋白酶将米糠蛋白水解破坏了其完整的结构，影响了对米糠蛋白结构的深入研究。目前，超声、高速混匀和冻融等物理方法已用于提取米糠蛋白，物理处理不易引起米糠蛋白的变性，在食品加工中比碱法和酶法更适于应用[9]。

超声和匀浆技术通常被认为是安全、无毒、环保的，对于食品行业，这使得超声优于其他技术而被广泛应用。超声辅助提取是利用超声波增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂的穿透力，提高药物溶出度，缩短提取时间的浸提方法。国内外已有人将超声波技术用于蛋白质的提取[10-12]。本研究拟采用胶体磨与超声结合辅助碱法提取米糠蛋白，通过响应面分析对超声条件进行了优化，确定最佳提取方案，以期提高米糠蛋白的提取率，缩短提取时间。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全脂米糠由黑龙江省农垦总局查哈阳农场提供，水稻品种为空育131。

正己烷、浓H2SO4、CuSO4、K2SO4、盐酸、Folin-酚试剂乙液、酒石酸甲钠、牛血清白蛋白、碳酸钠、氢氧化钠、氯化钠（均为分析纯） 天津市博迪化工有限公司。

1.2 仪器与设备

DK-S12型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；pHS-3C精密pH计 上海虹益仪器仪表有限公司；VC×150超声波破碎仪 北京中科科尔仪器有限公司；TDZ5-WS台式低速离心机 湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠原料的筛选

分别选用40、60、80、100 目的标准筛筛分米糠，获得4 种不同颗粒大小的米糠样品。用微量凯氏定氮法测定不同颗粒大小的米糠中蛋白质含量，并用常规碱法提取不同目数筛分的蛋白。

1.3.2 脱脂米糠的制备

参照Sze-tao等[13]方法并略作改动。按料液比1∶5（g/mL）加入正己烷磁力搅拌3 h，在浸提过程中更换正己烷3～4 次，混合料液于4 000 r/min离心15 min，沉淀摊匀于通风橱中挥发剩余溶剂，上清液通过旋转蒸发回收正己烷。

1.3.3 米糠营养成分的测定

蛋白质测定：参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质含量的测定》的凯氏定氮法；脂肪测定：参照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》的索氏抽提法；水分测定：参照GB/T 20264—2006《粮食、油料水分两次烘干测定法》；灰分测定：参照GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》于600 ℃灰化法。

1.3.4 胶体磨处理

将脱脂米糠以1∶10（g/mL）的料液比在室温条件下与蒸馏水混合，将混合料液在JMS-8D胶体磨下以恒速流通20 min。

1.3.5 米糠蛋白提取的工艺流程[8]

脱脂米糠→加入一定比例的蒸馏水→调节pH 9→超声（保持pH值保持不变）→离心（4 000 r/min离心15 min）收集上清液→调pH 4.5（4 000 r/min离心15 min）→沉淀冷冻干燥→米糠蛋白干粉

1.3.6 单因素试验

以超声时间、超声功率、液料比和超声提取温度进行单因素试验，提取液4 000 r/min离心15 min，记录上清液体积并用福林酚法测定提取液中蛋白质浓度，计算提取率。

1.3.7 响应面分析试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理[14]，以超声功率（X1）、液料比（X2）、超声温度（X3）、超声时间（X4）4 个因素为自变量，米糠蛋白的提取率（Y）为响应值，设计了四因素五水平共31 个试验点的响应面分析试验，其中24 个为析因试验，7 个为中心试验。利用Design Expert 8.0.6软件进行数据拟合，因素和水平见表1。

表1 响应面试验因素水平编码表Table1 Coded levels for factors used in quadratic regression rotational combinational design

1.3.8 提取率的计算

采用福林酚法[15]测定上清液中蛋白质的质量浓度。

2 结果与分析

2.1 米糠过筛目数的选择

由于生产环境或人为因素使米糠中掺杂少量杂质，会影响蛋白的提取效果[16]。分析40、60、80、100 目4 种样品的蛋白提取率和蛋白含量，结果见表2。

由表2可知，粒度为60 目米糠的蛋白含量和提取率最高，但40 目筛的米糠原料利用率较高，且相同质量的米糠提取的蛋白的量明显高于60、80 目和100 目筛。这是因为筛子目数过大，即物料直径减小，筛分米糠中淀粉含量较高，提取时容易形糊状，影响了蛋白的溶出。在实际生产中，以最终所得蛋白的产量为首要参考，综合考虑，选用过40 目筛的米糠为后续实验原料。

表2 不同粒径米糠的蛋白含量及提取率Table2 Protein contents and extraction rates of rice bran powders with particle sizes

2.2 米糠的营养成分

由表3可知，新鲜米糠中脂肪含量为26.7%，经正己烷脱脂后的米糠脂肪含量为5.92%，脱脂率为77.83%，说明正己烷有较好的脱脂效果。脱脂后米糠蛋白质含量高达15.76%，高于精白米本身的蛋白质含量（6%～10%）[17]，米糠是大米加工的副产品，是良好的植物蛋白资源，具有很大的开发潜力。

2.3 提取方法的比较

选择不同的方法提取米糠蛋白，以蛋白纯度和提取率为评价指标，结果如表4所示。

表4 不同提取方法对米糠蛋白提取率的影响Table4 Effect of extraction methods on the extraction rate of rice bran protein

由表4可知，常规碱液提取（pH 9）所得蛋白质提取率最低，经胶体磨处理后，蛋白提取率从59.43%增加到64.17%，蛋白纯度未见明显变化，与文献[18-19]的研究结果一致；进一步超声处理，提取率达到83.53%，纯度由71.87%增加到74.27%，蔡路昀等[20]的研究也表明超声辅助法能够显著地提高蛋白质的提取率。胶体磨使米糠混合液处于高水平机械剪切状态，减小了样品的粒径，使蛋白更容易被提取出来；而超声波在液体中的空穴作用增加了细胞内容物穿透能力，加速蛋白质的扩散溶出[21-22]，并且打破了蛋白质与其他非蛋白成分的结合和交联，进而使沉淀所得蛋白纯度提高。因此，胶体磨与超声协同辅助碱法能够显著地提高米糠蛋白的提取率（P＜0.05）。

2.4 米糠蛋白超声提取单因素试验

对胶体磨超声辅助碱法提取米糠蛋白进行单因素试验，在提取过程中pH值控制在9左右，超声时间4 s、间歇时间2 s。

2.4.1 超声温度对米糠蛋白提取率的影响

按液料比10∶1加入蒸馏水、超声功率80 W、超声时间20 min的条件下进行提取，温度对米糠蛋白提取率的影响如图1所示。

图1 超声温度对米糠蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction rate of rice bran protein

由图1可以看出，当提取温度从25 ℃升至45 ℃，提取率显著增加（P＜0.05），随着温度继续升高，蛋白提取率有缓慢下降的趋势。这可能是因为温度低于45 ℃时，分子的扩散速度慢，物料的空化作用不充分，从而降低了提取率；而由于温度和超声过程中产生的热效应共同作用使温度过高，引起物料糊化和蛋白质变性[20]，使蛋白形成大分子聚集体，从而降低了蛋白的提取率。同时考虑到高温需要投入较高的能耗，因此超声温度选择45 ℃。

2.4.2 超声功率对米糠蛋白提取率的影响

在液料比10∶1、超声时间20 min、超声温度45 ℃的条件下，考察超声功率对米糠蛋白提取率的影响。

图2 超声功率对米糠蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of rice bran protein

由图2可知，当超声功率小于60 W时，米糠蛋白提取率随功率的增大而增大（P＜0.05）。这是因为超声波可直接作用于分子，当功率增大时，分子的运动加剧，可快速破坏细胞壁，使蛋白更快的被分离提取出来[23]，当超声功率大于60 W时，蛋白提取率略有下降并趋于平缓。分析原因，可能是功率较大时，超声强度过大使空化起泡没有足够的时间破裂，空化效率降低，提取率下降。因此选用的超声功率为60 W。

2.4.3 超声时间对米糠蛋白提取率的影响

在液料比10∶1、超声功率80 W、超声温度45 ℃的条件下，考察超声时间对米糠蛋白提取率的影响，结果如图3所示。

图3 超声时间对米糠蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction rate of rice bran protein

由图3可知，超声时间对米糠蛋白的提取率影响较大，在提取 5～30 min内，随着时间的延长，物料不断地膨胀并且破碎度不断增加，使米糠蛋白较快的溶出；但在30 min后，蛋白提取率反而下降，可能是超声的时间过长，细胞内降解蛋白的酶也随着溶出，破坏了蛋白的结构，使提取率降低[24]。同时考虑到合理的生产周期，超声时间定为30 min。

2.4.4 液料比对米糠蛋白提取率的影响

液料比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，超声功率80 W、超声时间20 min、超声温度45 ℃的条件下进行提取，测定最终提取液中蛋白质含量，并计算提取率，结果见图4。

图4 液料比对米糠蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction rate of rice bran protein

由图4可以看出，随着液料比的增大，米糠蛋白的提取率逐渐增大并趋于平稳。这是因为在液料比较低时，提取液的黏度较高，产生较高的超声空化作用，致使超声所需的压力增大，空化阀也增大，影响分子的扩散速率，使得体系分散不均匀，导致提取效果不理想；但料水比过大，不仅浪费资源，也会为后面的浓缩工作带来困难。综合考虑，液料比为15∶1最合适。

2.5 响应面法优化胶体磨超声辅助提取米糠蛋白的工艺参数

2.5.1 模型的建立及显著性检验

通过软件对表5中的数据进行二次多远回归拟合，得到米糠蛋白提取率Y对X1、X2、X3和X4的二次多项回归方程为：

表5 响应面分析方案与试验结果Table5 Experimental design and results for response surface analysis

方程中各因素系数绝对值大小反映各因素对响应值的影响程度，系数的正、负反映影响的方向[25]。因为方程的二次项系数是负值，代表3D图形的抛物面开口向下，具有极大值点，可以进行优化分析[26]。对该模型进行显著性分析，结果见表6。由表6可知，模型显著性检验P＜0.01，R2=0.988 1，R2Adj=0.977 7，只有1.04%的误差，说明该方程的拟合度和可信度都很高；失拟项不显著（P=0.521 3），说明回归方程拟合充分，可以用该模型对胶体磨超声辅助法提取米糠蛋白的工艺进行分析和预测。

表6 回归模型方差分析Table6 Analysis of variance for the regression model

2.5.2 响应面分析与优化

椭圆图形的中心区域，蛋白提取率最高，椭圆排列越密集，说明因素变化对蛋白提取率影响较大。结果显示，每个因素对米糠蛋白提取率的影响都达到了极显著水平（P＜0.01），4 个因素影响大小顺序依次是X4＞X2＞X1＞X3；因素X1X2、X3X4、X2X4、X2X3的P＜0.05，说明因素间有显著的交互作用；X1X3、X1X4的P＞0.05，表明功率与温度、功率与时间没有显著的交互作用，图5为交互作用显著的三维图形及等高线图。

图5 各因素交互作用对蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of extraction parameters on the extraction rate of rice bran protein

2.5.3 最佳工艺参数

由该模型得到最优水平为超声功率68.65 W、液料比20∶1、超声时间40 min、超声温度45.90 ℃。在此条件下米糠蛋白提取率为92.14%。从实际条件分析，选定的最优参数是：超声功率69 W、液料比20∶1、超声时间40 min、超声温度46 ℃。在此条件下蛋白提取率进行3 次平行验证实验。蛋白提取率实际平均值为90.84%，相对误差为1.3%，与理论结果基本相符。经凯氏定氮法对最优条件下所得米糠含量进行测定，蛋白含量为73.31%。研究表明胶体磨超声辅助法能够显著地提高米糠蛋白的提取率，这种方法是切实可行的。

3 结 论

比较不同目数筛子对米糠蛋白提取率及纯度的影响，结果表明，米糠过40 目筛能够除去大部分杂质，使蛋白提取率和米糠的有效利用率达到最高；胶体磨超声辅助碱法能够显著地提高米糠蛋白的提取率，蛋白纯度为74.27%。

通过Design Expert 8.0.6 软件做响应面优化分析得胶体磨超声提取米糠蛋白的最佳工艺为超声功率69 W、液料比20∶1、超声时间40 min、超声温度46 ℃。在此条件下蛋白提取率进行3 次平行验证实验。蛋白提取率实际平均值为90.84%，相对误差为1.3%，与理论结果基本相符。表明胶体磨超声辅助法能够显著地提高米糠蛋白的提取率，这种方法是切实可行的。胶体磨超声辅助碱法所得米糠蛋白提取率高、时间短，为米糠蛋白的进一步研究提供理论依据。

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Optimization of Physical Force-Assisted Alkaline Extraction of Rice Bran Protein

XU Feng1, WANG Chang-yuan1,2,*
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

This study comparatively evaluated the efficiencies of alkaline extraction, colloid milling-assisted alkaline extraction, ultrasonic-assisted alkaline extraction, and colloid milling, ultrasonic-assisted extraction for the extraction of rice bran protein (RBP) with respect to RBP yield and purity. It was shown that a significantly increased extraction yield and a RBP purity of 74.27% were obtained by the colloid milling, ultrasonic-assisted extraction method. In this method, the extraction parameters ultrasonic power, solid-to-solvent ratio, temperature and extraction time were optimized by response surface methodology using the Design Expert 8.0.6. The optimum extraction conditions for maximizing RBP yield were determined as 40 mesh, 9, 69 W, 4 s, 2 s, 20:1 (mL/g), 40 min and 46 ℃ for rice bran granularity, pH, ultrasonic power, working time, intermittent time, solid-to-solvent ratio, ultrasonication time and extraction temperature, respectively. The predicted extraction yield of RBP was 92.14%, agreeing with the experimental value (90.84%). The colloid milling, ultrasonic-assisted extraction method could significantly increase the extraction yield of RBP and shorten the extraction time and thus could provide a foundation for for further study of rice bran protein.

rice bran protein; physical force-assisted alkaline extraction; extraction yield; response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630（2014）20-0011-06

10.7506/spkx1002-6630-201420003

2013-11-12

国家自然科学基金青年科学基金项目（31101387）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD34B00）；黑龙江省教育厅科学技术项目（12531446）

许凤（1988—），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：xufeng890727@163.com

*通信作者：王长远（1976—），男，副教授，博士，研究方向为食品科学、粮油及植物蛋白。E-mail：byndwcy@163.com