高效液相色谱法同时测定大庆马齿苋中山奈酚和槲皮素的含量

韩成花 白玉华 于春月 高赛男 杨璐铭

哈尔滨医科大学（大庆），黑龙江大庆 163319

马齿苋为马齿苋科植物马齿苋Portulaca oleracea L.的干燥地上部分，又名长寿菜、马齿菜、酸苋、五行草、长命菜、蚂蚁菜、酱板菜、酸味菜等，夏、秋二季采收，除去残根和杂质，洗净，略蒸或烫后晒干[1]。马齿苋性酸味寒，具有清热利湿、凉血解毒的功效。马齿苋营养丰富，含有大量蛋白质、钙、磷、铁、氨基酸、维生素等营养成分，还含有有机酸类、黄酮类、生物碱类、萜类、香豆素类等化学成分，是夏季人们喜爱的野生植物之一，而且现代药理研究表明马齿苋具有降血脂、降血糖、抗衰老、消炎抑菌、增强免疫等多种保健功能和治疗疾病的作用[2-3]，是药食两用的植物。

马齿苋对生长环境要求较低，耐旱、耐涝、抗寒，生活力极强，在大庆的盐碱地也能生长，主要生于菜园、农田、路旁等地。 大庆地区大多为盐碱地，若能种植中药马齿苋，即充分利用了大庆的资源，也能改善生态环境，也会为大庆地区带来巨大的经济效益和社会效益。

山奈酚和槲皮素为马齿苋的主要成分，测定其含量对控制该药材质量具有重要意义。本研究通过高效液相法同时测定大庆马齿苋中山奈酚和槲皮素的含量，为大庆地区马齿苋的开发利用提供理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

KH3200DE 超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），ESJ200-4 电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司），Agilent 1200 Series 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 试剂

芦丁、槲皮素、山奈酚对照品购自北京世纪奥科生物技术有限公司，马齿苋采自大庆市萨尔图区，经哈尔滨医科大学（大庆）药学院白玉华教授鉴定。 甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司），纯净水（吉林娃哈哈饮用水有限公司），其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 样品和对照品溶液的制备

精密称取大庆地区马齿苋药材粉末0.5102 g，加入甲醇50 mL，超声提取[4-5]（功率80 W，频率20 kHZ，温度40℃）1 h 后，过滤，滤液转移到50 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，使混匀，过微孔滤膜（0.45 μm），即为样品溶液。

精密称取槲皮素对照品0.0062 g 以及山奈酚对照品0.0056 g，置于25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即为混合对照品溶液。

2.2 高效液相色谱条件的选择[5-15]

色谱条件：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）P/N993967-902 为色谱柱；流动相为甲醇-0.2%磷酸（45∶55）；检测波长360 nm；柱温25℃；流速1.0 mL/min。在此色谱条件下，混合对照品溶液（图1）中槲皮素和山奈酚的分离度好，大庆马齿苋样品溶液色谱图（图2）与混合对照品溶液色谱图中槲皮素和山奈酚的保留时间一致。 因此，上述色谱条件可用于同时检测大庆马齿苋中山奈酚和槲皮素的含量。

图1 混合对照品色谱图

图2 大庆马齿苋样品色谱图

3 结果

3.1 绘制标准曲线

准确吸取适量的混合对照品溶液，进样量分别为0、2、4、6、8、10 μL，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制槲皮素的标准曲线：Y=1083.9X-8.0567，r = 0.9997，在0.496～2.480 μg 范围内线性关系良好（图3）。 以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制山奈酚的标准曲线：Y=860.95X-16.472，r = 0.9997，在0.448～2.240 μg 范围内线性关系良好（图4）。

图3 槲皮素标准曲线

图4 山奈酚标准曲线

3.2 精密度测试

精密吸取混合对照品溶液，进样5 次，每次10 μL，测得槲皮素的峰面积RSD=0.30%，山奈酚的峰面积RSD=0.28%，显示仪器的精密度良好。

3.3 稳定性测试

精密吸取同一样品溶液，在0、2、4、6、8、10、12 h 的时间间隔内分别进样10 μL，测定峰面积，槲皮素的峰面积RSD 分别为0.10%、0.10%、0.12%、0.21%、0.21%、0.33%，山奈酚的峰面积RSD 分别为0.14%、0.08%、0.14%、0.14%、0.16%、0.24%，说明在12 h 内样品稳定可靠。

3.4 重复性测试

测得槲皮素的平均含量为0.0395%，RSD=2.50%，山奈酚的平均含量为0.0483%，RSD=3.01%，表明此方法的重复性良好（表1）。

表1 HPLC 法的重复性实验结果

3.5 加样回收率实验

槲皮素的平均回收率为98.10%，RSD = 0.45%（表2），山奈酚平均回收率为96.90%，RSD = 0.63%（表3）。 该方法稳定、可靠，可用于大庆地区马齿苋黄酮类化合物含量测定。

表2 HPLC 法槲皮素回收率实验结果

表3 HPLC 法山奈酚回收率实验结果

3.6 样品的测定

取3 份马齿苋药材，按“2.1”项下制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定槲皮素和山奈酚的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果

4 讨论

本实验是在研究大庆马齿苋总黄酮含量测定方法（用以槲皮素为对照的AlCl3显色法）的基础上，为进一步完善大庆马齿苋质量标准，做了高效液相色谱法测定马齿苋中黄酮类化合物的研究。相关文献中也表明马齿苋中主要含游离黄酮类化合物如： 槲皮素、山奈酚等化学成分[5]。 因此本实验用高校液相法同时测定大庆马齿苋中山奈酚和槲皮素的含量，其高效液相的色谱条件和样品、对照品溶液的配制参考了相关文献[5-15]并进行了反复的摸索，最终确定了最佳的实验条件：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱；流动相为甲醇-0.2%磷酸（45∶55）；检测波长360 nm；柱温25℃；流速1.0 mL/min。

大庆马齿苋中黄酮含量比其他文献[5]中的黄酮含量高，说明大庆马齿苋药材质量较好，利用荒废的盐碱地大量人工栽培马齿苋，能将为大庆带来巨大的经济效益。

本实验采用高效液相色谱法同时测定大庆马齿苋中山奈酚和槲皮素的含量，并通过方法学考查探讨了方法的可行性。此方法灵敏度高，精确度高，分离效能高，可以成为测定大庆地区马齿苋中山奈酚和槲皮素含量的理想方法。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出社，2010：46-47.

[2] 杜建华.中药马齿苋的药用价值和营养价值[J].中国现代药物应用，2010，4（19）：223-224.

[3] 丁怀伟，姚佳琪，宋少江.马齿苋的化学成分和药理活性研究进展[J].沈阳药科大学学报，2008，25（10）：831-838.

[4] 赵进，刘娇，罗建华，等.超声波提取百色马齿苋总黄酮及其鉴别[J].时珍国医国药，2007，18（7）：1714-1715.

[5] 王锦军，杨成雄.马齿苋中黄酮化合物的高效液相色谱分析[J].解放军药学学报，2010，26（4）：345-347.

[6] 潘晓军，吕圭源，陈素红，等.RP-HPLC 同时测定白花木花中的槲皮素和山奈酚[J].光谱实验室，2012，29（3）：1717-1720.

[7] 黄志勤，程齐来，李洪亮.RP-HPLC 测定细梗胡枝子中3种黄酮类有效成分[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（4）：70-72.

[8] 李丹，杨冉，曾华金，等.RP-HPLC 同时测定金钱通淋颗粒中槲皮素、木犀草素及山奈酚的含量[J].郑州大学学报：医学版，2010， 45（1）：145-147.

[9] 梁臣艳，甄汉深，马雯芳，等.高效液相色谱法测定广西余甘子叶中槲皮素和山奈酚的含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（8）：41-43.

[10] 代光秀.高效液相色谱法测定罗布麻茶中槲皮素的含量[J].中国中医药信息杂志，2008，15（5）：52-53.

[11] 郭炬亮，李新霞，支玲.HPLC 测定糙枝金丝桃中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚含量[J].中国实验方剂学杂志，2013， 19（11）：75-78.

[12] 孟宪波.HPLC 测定凤眼草中槲皮素与山柰素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（8）：77-79.

[13] 潘治峰.山奈酚的含量测定[J].医学信息，2013，（25）：485.

[14] 陈海霞，刘向红，梁宏臣.HPLC 法测定烟台柴胡中芦丁和槲皮素的含量[J].安徽农业科学，2013，41（8）：3382-3479.

[15] 覃兰芳，胡琦敏，赖茂祥，等.HPLC 同时测定小蜡树叶中槲皮素与山奈素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：107-109.