牛源犬新孢子虫IMP1基因的克隆与序列分析

张蕾，贾立军，鲁承

(延边大学农学院动物医学系，吉林延吉133002)

新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫引起的多种家畜的一种原虫病，该病可引起孕畜的流产、死胎，以及新生胎儿的运动障碍和神经系统疾病［1］。1988年Dubey等从瘫痪后肢的犬体分离了虫体，将其命名为犬新孢子虫［2］。犬新孢子虫为专性细胞内寄生原虫，隶属于复顶亚门原生动物门新孢子虫亚纲孢子虫纲新孢子虫属。新孢子虫病分布于世界各地，瑞士、挪威、芬兰、哥斯达黎加、爱尔兰、菲律宾、越南、泰国、以色列、俄罗斯、古巴等国都有因为新孢子虫病引发母牛流产的事件［3］。该病给畜牧业造成了巨大的经济损失，严重危害了养殖业的健康发展［4－5］。IMP1是2011年在巨型艾美耳球虫内发现的一类具有免疫保护性的蛋白，但该蛋白的来源和功能尚不明确。Cui等对犬新孢子虫IMP1基因蛋白进行了鉴定和定位的初步研究［6］。为了解牛源犬新孢子虫IMP1基因的生物学特性，笔者对IMP1基因进行克隆与序列分析，旨在为IMP1基因的表达及后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与虫株。Ecoli.DH5α 菌株、犬新孢子虫吉林株和感受态，均来自延边大学预防兽医学实验室。

1.1.2 主要试剂。DNA Marker2000、pMD18-T Simple Vector、XhoⅠ、Eco RⅠ和 ExTaq DNA 聚合酶，购自宝生物工程公司(大连);质粒提取试剂盒、蛋白酶K、溶菌酶和DNA凝胶回收试剂盒，购自OMEGA公司;其他试剂均为国产分析纯级，市售。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计及合成。应用Primer Premier5.0及Oligo6.0软件设计了一对引物P1、P2，引物由上海英骏生物技术公司合成。(P1)上游:5'CGGGATCCATGGGAGGCGTTTGCTCTAA 3';(P2)下游:5'CGGAATTCTTCAATGCCGGTCAGAAGC 3'。

1.2.2 IMP1基因的PCR扩增与鉴定。以犬新孢子虫吉林株基因组DNA为模板，PCR反应总体系为25μl:2μl dNTP，模板 DNA 5 μl，上下游引物各 1 μl，Taq 酶 0.25 μl，2.5 μl 10×PCR Buffer，ddH2O 13.25 μl。优化 PCR 反应条件为:95℃预变性5 min，94℃变性45 s，58℃退火1min，72℃延伸1 min，进行30个循环，最后72℃条件下延伸10 min。PCR反应结束后，将其产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 IMP1基因的克隆。用 pMD18-T Simple Vector与纯化回收的IMP1片段进行连接，转入E.coli.DH5α感受态细胞，涂布于LB固体培养基上(含有Amp抗性)筛选阳性菌落。

1.2.4 重组质粒的PCR鉴定与酶切鉴定。提取重组质粒DNA，应用P1、P2进行 PCR 鉴定;应用 Eco RⅠ和 Bam HⅠ进行双酶切鉴定。

1.2.5 IMP1基因片段的序列测定与分析。将鉴定正确的阳性克隆质粒送往上海英俊生物技术公司进行测序，并使用分子生物学软件DNAstar系统对测序结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增 以提取的犬新孢子虫吉林株基因组DNA为模板，P1、P2为引物，扩增出片段长度为762 bp的IMP1基因片段(图1)。

2.2 重组质粒pMD18-IMP1的鉴定 将IMP1基因与pMD18-T Simple Vector质粒连接，从而获得重组克隆质粒pMD18-IMP1，进行PCR扩增，得到与目的基因片段大小一致条带，说明重组质粒中含有IMP1基因。经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定，得到762 bp的目的片段和2 692 bp的载体片段(图2)，说明IMP1基因成功克隆到pMD18-T Simple Vector上。

图1 目的基因PCR扩增结果

图2 重组质粒pMD18-IMP1的酶切鉴定结果

2.3 重组质粒pMD18-IMP1的序列测定 测序结果表明，克隆得到的IMP1基因核苷酸长度为762 bp，编码243个氨基酸。核苷酸序列197位上测序为A，而NCBI中为T，与Gen Bank(XM_003879531.1)中IMP1基因核苷酸的同源性为99.9%(图3)。而氨基酸66位编码的赖氨酸，突变之后编码甲硫氨酸，氨基酸同源性为99.6%(图4)。

图3 IMP1基因序列与GenBank上(XM_003879531.1)序列同源性比较

图4 IMP1基因编码氨基酸序列的同源性比较

3 讨论

禹海杰通过间接免疫荧光技术对弓形虫速殖子不同时期IMP1蛋白的表达特性研究发现，在游离、吸附于细胞表面、入侵中、入侵后及纳虫空泡中的速殖子IMP1均有表达，均被定位于虫体表面，且在有些虫体的顶端表达更为强烈［7］。Cui等对犬新孢子虫IMP1基因蛋白研究表明，IMP1基因蛋白编码1 182 bp的开放阅读框，编码393个氨基酸，编码的蛋白约42.9 kDa，该氨基酸序列没有信号肽和跨膜区，但有9个酰基化位点和14个磷酸化位点。试验选择IMP1开放阅读框内基因片段进行扩增与克隆，目的是为IMP1基因的表达和生物学特性的研究奠定基础。

试验对构建的IMP1基因重组质粒进行测序，得到的IMP1基因核苷酸长度为762 bp，编码243个氨基酸。核苷酸序列197位上测序为A，而NCBI中为T，与GenBank(XM_003879531.1)中IMP1基因核苷酸的同源性为99.9%;氨基酸66位编码的赖氨酸突变为甲硫氨酸，氨基酸同源性为99.6%，该突变是否对蛋白的表达及其他特性造成影响还有待于进一步研究。

［1］BJERKAS I，MOHN SF，PRESTHUSJ.Unidentified cyst-forming sporzoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs［J］.Zeitschr Parasitenkunde，1984，70(2):271 －274.

［2］DUBEY JP，CARPENTER JL，SPEERCA，etal.A newly recognized fatal protozoan disease of dogs［J］.JAm VetMed Assoc，1988，192(9):1269 －1285.

［3］OOIH K，H UANG C C，YANG C H，et al.Serological survey and first finding of Neospora caninum in Tai-wan，and the detection of its antibodies in various body fluids of cattle［J］.Veterinary Parasitology，2000，90:47 －55.

［4］邓冲，张维，刘群，等.乳牛流产胎儿中新孢子虫的鉴定［J］.中国兽医科学，2007，37(1):16 －19.

［5］张守发，丁德，鞠玉琳，等.胶体金免疫层析法与ELISA法对牛的新孢子虫血清抗体检测结果的比较［J］.中国兽医杂志，2008，44(8):54－55.

［6］CUIX，LEIT，YANGD Y，etal.Identification and characterization ofa novel Neospora caninum immunemapped protein 1 ［J］.Parasitology，2012，139(8):998－1004.

［7］禹海杰.弓形虫疫苗候选抗原IMP1生物学特性及其免疫原性研究［D］.杭州:浙江大学，2013.