干预DAG－PKC信号转导通路对糖尿病大鼠心肌细胞JNK1和IRS1基因表达的影响

王生级 吴 伟＊ 范晓婷 李延辉

（1中国医科大学附属第一医院急诊科；2辽宁省金秋医院，沈阳110001）

糖尿病（DM）患者的心脏受各种病理的侵蚀，包括加速的动脉粥样硬化，心脏自主神经病变，内在的心肌病变［1］。这种在糖尿病（DM）基础上发生的心肌病变，称其为糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy，DCM），其发病机制中，DAG－PKC途径过度激活起着枢纽作用，DAG－PKC通路的激活，被证明是早期引起糖尿病心功能失常的重要机制，本研究将在过去研究的基础上以STZ诱导的糖尿病大鼠模型为基础，深入探讨早期糖尿病心肌病的病理变化，以及PKC－β2和JNK1的关系，观察DCM发生发展的变化，为预防及治疗糖尿病心肌病提供干预的理论基础。

材料和方法

1．实验主要试剂

STZ（美国Sigma公司）、兔抗大鼠PKCβ2和兔抗大鼠JNK1（武汉博士德生物工程有限公司）、兔抗大鼠IRS1（北京博奥森生物技术有限公司）、Triozol Reagent（美国Invitrogen Life technologies公司）、荧光定量PCR试剂盒（大连宝生生物工程有限公司）。

2．糖尿病模型建立及分组

SPF级SD系大鼠60只，由中国医科大学实验动物部提供，随机分成对照组（C组）、糖尿病模型组（A组）与糖尿病LY333531（10mg·kg－1·d－1）灌胃给药干预组（B组），每组各20只。

3．模型建立

正常饲养1w后，禁食24h，期间自由饮水，实验组大鼠按60mg／kg链脲佐菌（STZ）溶液（临用前用0．1mol／L柠檬酸缓冲液溶解，pH4．5）一次性左下腹腔注射，对照组注射等量柠檬酸缓冲液。72h后检测尿糖、血糖情况，以空腹血糖＞11．1mmol／L，非空腹血糖＞16．7mmol／L，尿糖定性≥＋＋＋，动物多饮、多食和尿量增加者确定为DM模型。所有大鼠在整个实验期间均喂标准饮食，自由饮水，不应用胰岛素，整个实验观察8w，饲养至相应周数处死取材。

4．血糖及体重测定

采用罗氏Accu－CHEK．Active血糖仪，在禁食12h后，取大鼠尾末梢毛细血管全血测定空腹血糖。称量大鼠体重。均为每周1次。

5．全心重量和左室重量的测定

在病程8w末分别从3组大鼠中随机选择10只，所有大鼠称重后，用3%的戊巴比妥钠2ml腹腔注射麻醉，剪开胸骨，暴露心脏，从主动脉根部水平离断心脏，用冷生理盐水充分冲洗后，滤纸吸干，称重。分离左心室，称重。分别计算心体比（全心重／体重，H／W）及左室指数（左室重／体重，left ventricular mass index，LVMI）。

6．心脏组织 HE

染色和心肌胶原纤维 Masson染色：病理标本用10%中性福尔马林常规方法固定24h，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，进行HE染色。采用显微图象分析系统（MetaMorp／DP10／BX41），每张切片选择5个视野，测量胶原纤维染色阳性面积，并计算心肌胶原容积分数（CVF），公式如下：CVF%＝胶原面积／全视野面积×100%，并计算平均值。

7．电镜观察

将1mm3大小的心肌组织固定于2．5%戊二醛中，PBS漂洗，1%锇酸固定，常规乙醇脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片（70nm），醋酸铀、柠檬酸铅染色，JME－1200EX电镜观察、拍片。

8．免疫组化分析

SABC法检测JNK1、IRS－1、PKC－β2表达，采用形态学图像分析系统软件，每张切片随机检测5个视野，然后计算每个标本的平均光密度值（MOD），以 MOD 作为JNK1、IRS－1、PKCβ2表达水平的半定量参数。

9．Real－Time PCR检测JNK1mRNA 和IRS－1mRNA的表达

①参照Trizol说明书（Invitrogen公司）采取一步法提取总RNA，②RNA浓度和纯度测定：取1μl RNA样本，加79μl DEPC水，紫外分光光度计测OD260与 OD280，二者比值1．8－2．0提示样本中RNA纯度合格。（3）逆转录合成cDNA：用试剂盒合成cDNA（北京华大基因公司），严格按照说明书进行。（4）PCR扩增：用上述引物进行实时定量PCR反应，ABI 7500扩增仪（德国Biometra）。

10．统计学分析

采用SPSS13．0统计学软件对实验数据进行处理，试验结果以均数±标准差（¯x±s）表示，采用方差分析或t检验，P＜0．05表示差异有显著意义。P＜0．01表示差异非常显著。

结 果

1．一般指标变化

与C组相比，A组及B组血糖明显升高（P＜0．01）、体重明显降低（P＜0．01）、A组及B组血糖无明显差异，B组体重高于A组（P＜0．05），A组及B组左室重、心体比、左室质量指数明显高于C组（P＜0．01，P＜0．01，P＜0．01），A组与B组间亦有明显差异（P＜0．01，P＜0．01，P＜0．01）（见表1）。

表1 各组一般指标变化±s）Table 1 Values of FBG、BW、HW、LVH、H／B and LVMJ in rats

表1 各组一般指标变化±s）Table 1 Values of FBG、BW、HW、LVH、H／B and LVMJ in rats

注：与对照组比较：＃P＜0．01；与干预组比较：＊P＜0．01Compared with Group C：＃P＜0．01；Compared with Group B：＊P＜0．01

组别Group例数n空腹血糖FBG（mmol／L）体重BW（g）全心重HW（g）左室重量LVH（g）心体比H／B（10－3）左室质量指数LVMJ（10－3）C组 10 7．00±1．1 312．5±17．08 0．84＋0．17 0．74＋0．04 2．7±0．06 2．37±0．02 A组 10 26．8±2．9＃ 203．8±4．79＃＊ 0．79±0．39＃＊ 0．59±0．02＃＊ 3．6±0．17＃＊ 2．94±0．07＃＊B组 10 27．9±1．2 247．5±18．9 0．73±0．18 0．61±0．05 3．2±0．13 2．49±0．01

2．心肌间质纤维化评价

HE染色可见C组大鼠心肌排列整齐，横纹肌清晰，A组细胞排列紊乱，有局灶性坏死，干预后有所改观。Masson染色中胶原纤维呈蓝绿色，肌纤维呈红色。C组胶原分布均，A组心肌内胶原纤维明显增多、排列紊乱、分布不均，紧密围绕心肌细胞及小血管周围。B组心肌内胶原纤维明显减少，A组大鼠心肌胶原容积分数（CVF）和血管周围胶原面积（PVCA）显著增加，以PVCA增加更为显著，约为正常的2．5倍，而CVF约为正常的2倍（表2，图1，图2）。

表2 各组心肌间质纤维化指标变化（±s）Table 2 Changes of CVF and PCVA of rat in different groups

表2 各组心肌间质纤维化指标变化（±s）Table 2 Changes of CVF and PCVA of rat in different groups

注：与C组比较：＃P＜0．01；与B组比较：＊P＜0．01Compared with Group C：＃P＜0．01；Compared with Group B：＊P＜0．01

组别 例数 CVF（%） PCVA（%）C组10 3．19±0．57 7．15±1．06 A组 10 9．57±0．94＃＊ 18．32±4．41＃＊B组10 6．41±1．58 12．14±0．22

3．电镜结果

C组大鼠心肌细胞含大量肌丝，肌丝排列规则，明暗带清晰可见。线粒体正常，呈圆形或椭圆形，嵴发达明显，排列密集。心肌细胞间可见闰盘连接，排列整齐。A组心肌细胞内肌原纤维含量明显减少，肌丝排列紊乱、稀疏，部分肌丝断裂、扭曲，局部溶解，丧失，明暗带不明显。线粒体排列紊乱，部分线粒体肿胀明显，嵴变宽、断裂、甚至消失，线粒体基质密度下降，且内形成空泡。干预后，心肌细胞肌原纤维含量较糖尿病组有所增加，肌丝排列整齐，线粒体轻度肿胀，嵴间隙略有增宽，部分融合断裂，线粒体内空泡结构减少（图3）。

4．免疫组化结果

各组图片使用显微图象分析系统（MetaMorp／DP10／BX41）进行光密度值分析，结果显示，A组PKCβ2、JNK1、p－JNK、IRS1平均光密度值（MOD）明显高于C组，B组较A组表达减少，差异均具有统计学意义（P＜0．05）（表3，图4－图8）。

表3 各组大鼠心肌PKC、JNK、P－JNK、IRS－1的平均光密度值（MOD）比较（¯x±s）Table 3 The average optical density of pkc、JNK、P－JNK、IRS－1of rat in different groups

5．Real－Time PCR 结果

C组大鼠心肌少量表达JNK1mRNA和IRS1mRNA，而A组大鼠心肌则显著升高，是C组的30倍 和20倍（P＜0．01）。干 预 后，大 鼠 心 肌JNK1mRNA和IRS－1mRNA的表达水平明显下调。

讨 论

关于糖尿病心肌病发病机制的研究，以往主要集中在心肌细胞的代谢，钙离子转运以及氧自由基异常等，有关细胞内信号转导和细胞功能调节在糖尿病心肌病中的研究越来越受到重视，其发病机制中，DAG－PKC途径过度激活起着枢纽作用，PKC的激活，被证明是早期引起糖尿病心功能失常的重要机制［2］，PKC是由甘油二酯激酶亚型（DGKζ）控制大鼠心肌细胞DAG水平（将DAG分解成磷脂酸PA）来调节DAG－PKC的下游级联信号。对佐菌素（STZ）诱导的T1DM小鼠心肌细胞进行研究，发现PKCβ和δ亚型从胞浆易位到胞膜与减少心脏泵血功能和提高间质纤维化有因果联系；而在转DGKζ基因DM小鼠，PKCβ和δ亚型从胞浆易位到胞膜明显减少，并且没有出现明显的左室收缩功能障碍以及心肌纤维化［3］。本研究发现PKCβ2在糖尿病组大鼠心肌中大量表达，明显高于对照组和干预组。而高选择性PKCβ2抑制剂LY333531的初步应用也进一步确定了PKCβ2在糖尿病微血管病变中的作用［4］，对于众多的PKC同工酶，它们在心肌重塑中可能发挥不同的角色，其中PKCβ2可能激活c－jun N端蛋白激酶1（JNK1），从而影响到下游的信号［6－8］。

本研究结果显示，与C组相比，A组JNK1、PJNK1、IRS－1的表达明显升高（P＜0．01），干预 DAGPKC通路后，其表达相应减少。激活的JNK1不仅在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路中起作用，且能磷酸化胰岛素受体底物1（IRS－1），而IRS－1是受胰岛素（Isulin）或胰岛素样因子（IGF－1）刺激，这样JNK1就能对Insulin／IGF－1的IRS－1通路起到调节作用，即IRS－1激活磷酸肌醇3激酶（PI3K），PI3K进一步通过激活丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶／蛋白激酶B（Akt／PKB）通路，造成心肌肥厚和心脏衰竭［9］，而最新研究发现，在 Akt／PKB通路中，通过磷酸化mOTRser2448，影响哺乳动物雷帕霉素靶点（mOTR）作用，而其中的途径很复杂，目前还不清楚，只能了解到其中的一个效应是mOTRser2448受到磷酸化，从而激活了核糖体蛋白S6激酶1（p70S6K1），激活的p70S6 K1促进了缺氧诱导因子1（HIF1）和血管内皮生长因子（VEGF）的生成，加快了心肌肥厚［10－12］。

综上，DAG－PKC通路可能通过G蛋白受体和胰岛素受体途径的共同信号点JNK1影响下游的信号传导而导致糖尿病心肌病的发生发展，DAG－PKCJNK1－IRS1－Akt／PKB－mTOR－p70S6K1等一 系列信号位点可能是DAG－PKC信号转导通路引起糖尿病心肌病可能的潜在途径。目前我们面临的挑战是如何控制糖尿病心肌病发生的内在危险因素，现在仍有许多有待解决的问题。如果明确了糖尿病心肌病的发生机制，并采取针对性的干预措施，必将降低糖尿病心肌病的发病率和提高患者的生存质量。

图 版 说 明

图1 各组大鼠心肌组织masson染色结果（×400）

图2 各组大鼠心肌小血管周围masson染色结果（×400）

图3 各组大鼠心肌细胞组织透射电镜结果（×15000）

图4 各组大鼠心肌组织PKCβ2蛋白阳性表达（免疫组化×200）

图5 各组大鼠心肌组织JNK1蛋白阳性表达（免疫组化×200）

图6 各组大鼠心肌组织p－JNK1蛋白阳性表达（免疫组化×200）

图7 各组大鼠心肌组织IRS1蛋白阳性表达（免疫组化×200）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1Masson staining result of myocardium of rats in each group（×400）

Fig．2Masson staining result of tissue around small vessels in myocardium of rats in each group（×400）

Fig．3Transmission electron microscope changes of myocardial cell of rats in each group（×15000）

Fig．4Positive expression of PKC？劆？Ⅱin myocardium of rats in each group（immunohistochemisttry，×200）

Fig．5Positive expression of JNK1in myocardium of rats in each group（immunohistochemisttry，×200）

Fig．6Positive expression of p－JNK1in myocardium of rats in each group（immunohistochemisttry，×200）

Fig．7Positive expression of IRS1in myocardium of rats in each group（immunohistochemisttry，×200）

［1］Retnakaran R，Zinman B．Type 1diabetes，hyperglycaemia，and the heart．Lancet，2008，371，1790－1799

［2］Durgan DJ，Smith JK，Hotze MA，et al．Distinct transcriptional regulation of long－chain acyl—CoA synthetase isoforms and cytosolic thioesterase 1in the rodent heart by fatty acids and insulin．Am J Physiol Heart Circ Physical，2006，290：H2480－H2497

［3］Bilim O，Takeishi Y，Kitahara T，et al．Diacylglycerol Kinase zeta inaibits Myocardial atrophy and restores cardiac dysfunction in treptozotocin－induced diabetes inhibits mellitus．Cardiovascular Diabetology，2008，7（2）：1475－2840

［4］Arikawa E，Ma RC，Isshiki K，et al．Effects of insulin replacements，inhibitors of angiotensin，and PKCbeta＇s actions to normalize cardiac gene expression and fuel metabolism in diabetic rats．Diabetes，2007，56（4）：1410－1420

［5］Asghar O，Al＿sunni A，Khavandi K，et al．Diabetic cardiomyopathy．Clinical Science，2009，116（10）：741－760

［6］Liu X，Wang J，Takeda N，et al．Changes in cardiac protein kinase C activities and isozymes in streptozotocin－induced diabetes．Am J Physiol，1999，277（5Pt 1）：E798－804

［7］Ishii H，Koya D，King GL．Protein kinase C activation and its role in thedevelopment of vascular complications in diabe－tes mellitus．J Mol Med，1998，76（1）：21－31

［8］Chen J，Rockman HA．Acute Heart Failure．London：Springer，2008，89－110

［9］Liang Q R，Molkentin JD．Redefining the roles of p38and JNK signaling in cardiac hypertrophy：dichotomy between cultured myocytes and animal models．Molecular and Cellular Cardiology，2003，35（12）：1385－1394

［10］Spangenburg EE．Changes in muscle mass with mechanical load：possible cellular mechanisms．Appl．Physiol．Nutr．Metab，2009，34（3）：328－335

［11］Vary TC，Deiter GG，Lantry R．Chronic Alcohol Feeding Impairs mTOR（Ser2448）Phosphorylation in Rat hearts．Alcohol Clin Exp Res，2008，32（1）：43－51

［12］Canedo CS，Demeulder B，Ginion A，et al．Activation of the cardiac mTOR／p70S6Kpathway by leucine requires PDK1 and correlates with PRAS40phosphorylation．Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298：E761－E769