电针联合天麻多糖对脑缺血大鼠海马CA3区Nesin、BDNF表达的影响

缪化春 吴 锋 丁 见 熊克仁

（皖南医学院解剖学教研室，芜湖241002）

目前的研究已证实海马CA3区是脑缺血的耐受区［1］，脑缺血可通过诱导海马结构巢蛋白（Nestin）的表达，激活内源性神经干细胞（neural stem cells，NSCs），并使其向损伤区域移位从而发挥神经再生作用，而在脑缺血后CA3区锥体细胞分泌的脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表达在脑缺血后14d时明显增多，对中枢神经系统再生和修复起重要作用［2，3］。电针能促进脑缺血大鼠内源性NSCs的增生和分化，从而促进大鼠神经功能康复，中药天麻中的重要活性成分 天 麻 多 糖 （Polysaccharide of Gastrodia elata Blume，PGB）可促进神经组织的恢复，但机制尚不完全清楚［4，5］。电针联合PGB对脑缺血大鼠海马CA3区Nestin和BDNF的影响如何，尚未见报道。本实验对此进行研究，并对针药结合与单纯的药物、电针之间的疗效进行比较，以探讨PGB及电针联合PGB对脑缺血后损伤修复的作用及可能机制。

材料和方法

1．动物与分组

SD成年雄性大鼠40只，体重（200±20）g，由浙江省实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（浙）－2008－0033。将大鼠随机分为正常对照组、模型组、天麻多糖组、电针组和针药结合组，每组8只。

2．主要试剂及仪器

兔抗Nestin、兔抗BDNF及SABC免疫组化试剂盒（均为博士德公司），低频电子脉冲治疗仪（上海医用电子仪器厂，型号G6805－2），黑马病理图像分析仪（型号 Hema GSM－2000P，深圳）。

3．天麻多糖的提取

新鲜天麻洗净后去皮，切成片状，用匀浆机制成糊状，按参考文献［6］方法，采用水提醇沉提法得天麻粗多糖，再经过DEAE纤维素柱过柱分离，得到PGB。

4．造模方法

参照Zea Longa等［7］建立大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）脑缺血动物模型。大鼠经戊巴比妥钠30 mg／kg腹腔注射麻醉后仰卧位固定，颈部正中切开皮肤，钝性分离各层组织，暴露右侧颈总动脉。分离至颈内动脉、颈外动脉，将颈内动脉近心端扎紧，将尼龙线置入套管针，由颈内动脉插入，插入后用0号丝线结扎，将套管针抽出，继续插入至颅内，插入深度约18．5±0．5mm至微感阻力，使尼龙线头端通过大脑中动脉起始处，到达较细的大脑前动脉，结扎颈内动脉以固定尼龙线和防止出血，逐层缝合，尼龙线残端留lcm长于皮外。造模成功大鼠用于实验。

5．治疗方法

造模后2w，天麻多糖组和针药结合组大鼠分养，给予天麻多糖100mg／kg灌胃，每天1次，连续2w；电针组和针药结合组大鼠，以30号1寸毫针刺“百会”“足三里”穴，针柄连接至电针仪，给予低频（2Hz）电流刺激，强度为3V，波宽为1ms，持续30min，每天1次，连续2w；电针时以大鼠后趾轻微抖动为度，无剧烈挣扎、嘶叫。实验过程中对动物的处置符合有关善待实验动物的规定。

6．免疫组织化学方法

实验完成后，大鼠用30mg／kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，暴露心脏，经左心室－升主动脉插管灌注固定。先快速灌注温生理盐水100ml，再灌注4℃的1%多聚甲醛磷酸缓冲液300ml，30min内灌注完毕。取脑，后固定于4%甲醛固定液中，6h后，入梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。连续切片，片厚5μm，切片分两组收集。切片常规脱蜡至水，3%H2O2去除内源性过氧化物酶5－10min，95－98℃电炉热修复，断电两次，5%正常羊血清封闭，置37℃温箱1h之后滴加抗Nestin、BDNF抗体（稀释比例为1∶100），置湿盒内4℃过夜。第2天37℃温箱复温1h，滴加相应的生物素化的二抗，置37℃温箱2h，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素，置37℃温箱1h，DAB－H2O2显色10－30min。各步骤间均用 0．02mol／L PBS（pH7．2－7．4）洗5min×3次，阴性对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同，显色之后常规脱水、透明、中性树胶封片，光镜下观察。每组选取相同冠状切面的切片各16张（其中每只选取2张），利用黑马病理图像分析系统对200倍视野下海马CA3区的Nestin、BDNF免疫反应阳性细胞进行计数并测量1个单位面积免疫阳性产物的平均灰度值，每组8只大鼠的每个部位共测16个单位面积的灰度值。

7．统计学处理

实验数据以均数±标准差（¯x±s）表示，使用SPSS 13．0统计软件，采用单因素方差分析，组间比较用LSD检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．各组大鼠海马海CA3区Nestin的表达

各组大鼠海马CA3区均有Nestin的表达。Nestin阳性神经元呈棕黄色，Nestin免疫阳性产物着色部位主要为神经元的胞膜与胞浆。模型组CA3区Nestin阳性神经元数量较正常对照组增多，免疫阳性细胞平均灰度值降低（P＜0．05）；天麻多糖组、电针组、针药结合组海马CA3区Nestin阳性细胞数量均较模型组显著增多，免疫阳性细胞平均灰度值显著降低（P＜0．05）；针药结合组CA3区Nestin阳性细胞数量较天麻多糖组、电针组均显著增多，免疫阳性细胞平均灰度值显著降低（P＜0．05）（图1，表1）。

图1 各组大鼠CA3区Nestin阳性神经元的表达（免疫组化染色，×200），图中左下方标尺示50μm，右上方标尺示20μm。Fig．1The expression of Nestin IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats（IR，×200），Lower left Scale bar＝50μm，Upper right Scale bar＝20μm．

图2 多组大鼠海马CA3区BDNF阳性神经元的表达（免疫组化染色，×200图中左下方标尺示50μm右上方标尺示20μm。Fig．2The expression of BDNF IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats（IR，×200），Lower left Scale bar＝50μm，Upper right Scale bar＝20μm．

表1 各组大鼠CA3区Nestin免疫反应阳性细胞数量和平均灰度值（¯x±s，8只鼠／组）Table 1 The numbers and average gray value of Nestin IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats（x±s，8rats／group）

表1 各组大鼠CA3区Nestin免疫反应阳性细胞数量和平均灰度值（¯x±s，8只鼠／组）Table 1 The numbers and average gray value of Nestin IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats（x±s，8rats／group）

注：与正常对照组比较（vs the normal control group），P＜0．05；与模型组比较（vs the model group），P＜0．05；与针药结合组比较（vs the groups of EA＋PGB），▲P＜0．05。

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2．各组大鼠海马海马CA3区BDNF的表达

各组大鼠海马CA3区均有BDNF的表达。BDNF阳性神经元呈棕黄色，BDNF免疫阳性产物着色部位主要为神经元的胞膜与胞浆。与正常对照组比较，模型组CA3区BDNF阳性神经元数量增多，免疫阳性细胞平均灰度值降低（P＜0．05）；与模型组比较，天麻多糖组、电针组、针药结合组CA3区BDNF阳性神经元数量均显著增多，免疫阳性细胞平均灰度值显著降低（P＜0．05）；与天麻多糖组、电针组比较，针药结合组CA3区BDNF阳性神经元数量显著增多，免疫阳性细胞平均灰度值显著降低（P＜0．05）（图2、表2）。

表2 各组大鼠CA3区BDNF免疫反应阳性细胞数量和平均灰度值±s，8只鼠／组）Table 2 The numbers and average gray value of BDNF IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats±s，8rats／group）．

表2 各组大鼠CA3区BDNF免疫反应阳性细胞数量和平均灰度值±s，8只鼠／组）Table 2 The numbers and average gray value of BDNF IR－positive neurons in hippocampal CA3region in groups of rats±s，8rats／group）．

注：与正常对照组比较（vs the normal control group），＊P＜0．05；与模型组比较（vs the model group），△P＜0．05；与针药结合组比较（vs the groups of EA＋PGB），▲P＜0．05。

组别（Group） 阳性细胞数（The numbers of IR－positive neurons）平均灰度值（The average gray value）正常对照组（Normal）73．25±7．89 135．25±6．13模型组（Model） 83．50±8．33＊ 125．83±8．39＊电针组（EA group） 93．67±6．65＊△▲ 116．70±5．48＊△▲天麻多糖组（PGB group） 95．75±6．32＊△▲ 118．19±5．00＊△▲针药结合组（EA＋PGB group） 103．50±4．57＊△ 109．04±5．48＊△

讨 论

既往的研究表明，成年哺乳动物海马结构的齿状回的颗粒下层（SGZ）NSCs一般处于静止状态，各种脑损伤如脑缺血、创伤、癫痫、抑郁等可激活NSCs，分化形成的新神经元最终整合至海马功能的神经环路中，参与海马的各种功能活动，增殖的内源性NSCs存在由增殖区向靶区－－海马、皮质迁移的现象，在 脑 缺 血 损 伤 的 修 复 过 程 中 起 作 用［8，9］。Nestin属于一种胚胎性第VI类中间丝蛋白，参与细胞骨架的构成，是中枢神经系统发育过程中NSCs的标志之一，已广泛应用于NSCs的鉴定［1］。BDNF是神经元自身所支配的靶组织产生的一类含量极微的可溶性多肽分子，在神经元的修复及结构重建过程中起着重要作用；成年机体BDNF维持在较低水平，但在脑缺血等因素影响下内源性BDNF的表达可代偿性增加［10］。本实验结果显示脑缺血14d时，缺血侧海马CA3区Nestin和BDNF的表达显著高于正常组，提示脑缺血14d时海马CA3区的NSCs由齿状回增殖并迁移至此，CA3区锥体细胞分泌的BDNF有助于促进神经元的损伤修复。但单纯自身代偿性的内源性BDNF的上调表达不足以完全修复脑损伤［11］。因此，应用针刺、中药等外界刺激以上调海马CA3区BDNF的表达，促进脑缺血后NSCs增殖、分化和迁移，对脑损伤修复及神经功能恢复具有重要意义。

本实验对脑缺血大鼠应用PGB、低频（2Hz）电针针刺“百会”“足三里”穴及电针结合PGB治疗2w后。结果显示PGB组、电针组大鼠海马CA3区Nestin和BDNF的表达明显高于模型组；电针结合PGB组较单独电针组或PGB组CA3区Nestin和BDNF的表达均显著增加。电针是在针刺穴位“得气”后，在针上通以接近人体生物电的微量电流波，以刺激穴位，防治疾病的一种疗法，电针可促进局灶性脑缺血再灌注大鼠海马Nestin的表达增加［12］，电针可显著增加慢性脑缺血大鼠海马CA1区、大脑皮质BDNF的表达，对脑缺血损伤具有保护作用［13，14］。PGB是从新鲜天麻中除去天麻素等小分子物质后制备的大分子多糖［6］。有研究表明天麻素可以提高海马内源性BDNF的表达，具有神经保护作用［15］。本实验结果表明，PGB结合电针穴位针刺可显著增加脑缺血大鼠海马CA3区Nestin和BDNF的表达，提示针药结合可通过上调CA3区Nestin和BDNF的表达，促进内源性NSCs的增殖，以促进成年神经发生，有助于缺血性脑组织损伤的修复，这可能是电针结合PGB治疗脑缺血的重要作用机制之一。

有临床研究显示，针刺结合中药对改善脑梗塞患者的致残率有很好疗效［16］，我室曾研究表明电针与复方丹参片结合可显著增加慢性脑缺血大鼠海马CA1区BDNF的表达，且作用优于单用复方丹参片或电针［14］。本实验结果进一步提示针药结合对于脑缺血的疗效优于单独针刺或中药，为临床上应用电针结合中药天麻治疗脑缺血，促进患者神经功能的恢复提供了一定的形态学基础。但对于针药结合的效果优于单独电针或天麻多糖的原因还有待进一步研究。

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