补阳还五汤对脊髓损伤大鼠脊髓神经细胞凋亡的影响*

董贤慧，高维娟，贺小平，王志影，吴卫东

(1.承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000;2.河北中医学院;3.中国人民解放军第266医院;4.承德医学院2012级中药系本科)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)可分为原发性SCI和继发性SCI两个阶段。原发性SCI很难逆转，继发性SCI可被控制且具有可逆性，因此决定SCI预后的关键在于预防和治疗继发性SCI的发生和发展。目前，针对继发性SCI还没有切实可行而又行之有效的治疗方案，因此，还需要神经科学工作者投入更多的精力来寻找预防和治疗SCI的有效药物。补阳还五汤(Buyanghuanwu Decoction，BYHWD)有益气活血通络之功，应用BYHWD治疗SCI有一定的疗效，但具体作用机制目前还不是很清楚。本研究采用自制击打器建立大鼠SCI模型，采用TUNEL法检测大鼠脊髓神经细胞的凋亡情况，初步探讨BYHWD治疗SCI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康雌性Wistar大鼠30只，体重200-250g，天津市山川红实验动物科技有限公司提供，合格证号:0003327。大鼠适应性饲养2周后开始实验，饲养条件:20-29℃，相对湿度40-60% RH，自由进食水。BYHWD饮片颗粒剂由深圳华润三九现代中药有限公司馈赠，生黄芪120g、当归尾6g、赤芍5g、地龙3g、川芎3g、桃仁3g、红花3g混匀，用100℃蒸馏水配制成水溶液，浓度为含生药饮片2.0g/ml。

1.2 大鼠分组和处理 大鼠随机分为SCI模型组、假手术组和BYHWD组，每组10只。SCI模型组、BYHWD组大鼠采用“自制击打器”建立大鼠SCI模型;假手术组大鼠仅打开硬脊膜，不击打脊髓。待建立模型后，BYHWD组大鼠给予BYHWD(20ml/kg)连续灌服2周，1次/d;SCI模型组大鼠、假手术组大鼠给予等量生理盐水。

1.3 取材和指标检测 给药结束后处死大鼠，取T11-T12节段脊髓组织行TUNEL染色，TUNEL反应阳性为细胞核呈现棕黄色。于400倍光镜下计数TUNEL染色阳性细胞数并计算凋亡指数(apoptosis index，AI):400倍镜下选取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算凋亡细胞数所占比例，取平均值。

2 结果

大鼠麻醉清醒后，假手术组大鼠行走轻度异常，术后1d完全恢复正常;SCI模型组和BYHWD组大鼠造模后损伤平面以下完全瘫痪，用药2周后BYHWD组大鼠运动功能逐渐好转。TUNEL结果显示:与假手术组大鼠比较，模型组大鼠神经细胞凋亡指数明显升高(P＜0.05);与模型组大鼠比较，BYHWD组大鼠神经细胞凋亡指数明显降低(P＜0.05)。见附表:

附表 各组大鼠脊髓神经细胞凋亡指数(±s)

附表 各组大鼠脊髓神经细胞凋亡指数(±s)

与SCI模型组比较:*P＜0.05

组别 例数 凋亡指数(AI)假手术组 10 2.13±0.35*SCI模型组 10 65.73±1.25 BYHWD组 10 20.05±1.48*

3 讨论

Allen[1]于1911年提出的SCI分为原发性SCI和继发性SCI两个阶段的理论，成为SCI治疗理念的一个里程碑。原发性SCI是指机械性损伤，受伤程度由受伤当时决定，损伤很难逆转;而继发性SCI是指发生于原发性损伤之后的一系列损伤，具有可逆性、可被控制，因此防治继发性SCI是治疗SCI的关键。

继发性SCI的主要病理变化是神经细胞死亡，以往认为继发性SCI的细胞死亡神经细胞坏死，近年来有实验研究证实，SCI时除神经细胞坏死外，还存在神经细胞凋亡。神经细胞坏死发生在SCI后急性期，以细胞肿胀破裂为主要形式;神经细胞凋亡以核染色质固缩、DNA断裂、电泳呈梯带分布为特征，是SCI后神经细胞死亡的主要方式[2]。国内外许多研究者已经发现，在中枢神经系统缺血性和机械性损伤模型中，广泛存在DNA损伤，可表现为神经细胞凋亡、DNA的片段化和转录水平修复相关基因表达等[3]。

SCI的治疗包括手术治疗和药物治疗。手术治疗主要是对损伤节段进行减压、复位、固定以及融合，但有研究认为脊髓全横断损伤不宜采用手术治疗[4]。临床上最常用于治疗SCI的药物是皮质类固醇激素—甲基强的松龙(MP)，此外，甘露醇、自由基清除剂、神经节甙脂、阿片受体拮抗剂、钙离子通道阻滞剂、兴奋性氨基酸拮抗剂、内皮素(ET)受体拮抗剂、β-七叶皂甙钠、抑制细胞凋亡类药物、促红细胞生长素(EPO)、神经营养素、褪黑激素、人参皂苷、腺苷、CTP、软骨素酶等药物也逐渐被应用于SCI的治疗，但疗效并不乐观[5]。目前，还没有一种治疗SCI切实可行而又行之有效的方案。

BYHWD由生黄芪、川芎、当归尾、地龙、桃仁、红花、赤芍等7味中药组成，具有补气活血、祛瘀通络的功效，原用于气虚血瘀型中风所致半身不遂、口眼歪斜、语言謇涩等症。近年来，国内一些学者开始从事BYHWD治疗SCI的实验研究，发现BYHWD对SCI动物模型后肢感觉功能及运动功能的恢复有一定疗效[6]。

本研究采用自制击打器建立SCI模型，该方法是一种操作简便，且易于复制的SCI动物模型[7]。应用该方法所建立的大鼠SCI模型较接近人SCI的病理生理特点和变化规律，能很好的模拟人脊髓的受损过程，可以用于探索SCI后神经保护策略的研究。同时，本研究采用TUNEL法检测大鼠脊髓损伤后脊髓神经细胞的凋亡情况，结果发现SCI后确实存在脊髓神经细胞的凋亡，应用BYHWD治疗可明显降低SCI模型大鼠脊髓神经细胞的凋亡指数，表明BYHWD可通过抑制神经细胞凋亡对SCI时脊髓损伤发挥保护作用。

[1] Allen AR. Surgery of experimental lesion of spinal and equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column[J]. JAMA,1911, 6(11): 878-880.

[2] Bracken MB,Holford TR. Effects of timing of methylprednisolone or naloxone administration on recovery of segmental and longtract neurological function in NASCIS 2[J].J Neurosurg,1993,79(4):500-507.

[3] Budihardjo I, Oliver H, Lutter M, et al. Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis[J]. Annu Rev Cell Dev Biol,1999, 15: 269-290.

[4] Shamim MS, Ali SF, Enam SA. Non-operative management is superior to surgical stabilization in spine injury patients with complete neurological deficits: A perspective study from a developing world country, Pakistan [J]. Surg Neurol Int, 2011, 2: 166.

[5] Domingo A, Al-Yahya AA, Asiri YA, et al. A systematic review on the effects of pharmacological agents on walking function in people with spinal cord injury[J]. J Neurotrauma, 2012, 29(5):865-879.

[6] 张继平，王志彬，林爱华，等.补阳还五汤对脊髓损伤大鼠脊髓组织血小板活化因子含量的影响[J].中国中医药信息杂志，2011，18(11):46-48.

[7] 董贤慧，贺小平，赵利兵，等.自制击打器建立大鼠脊髓损伤模型[J].承德医学院学报，2013，30(4):285-287.