加速试验法研究黄芩药材的贮藏稳定性

徐杨璐，赵胜男，刘素丽，李守拙

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

中药材是一个复杂的混合体系，其质量好坏直接影响中药材、中药饮片和中成药的临床疗效。除采收期和采收年限影响中药材的质量外，药材贮藏期也是中药质量控制的重要环节之一[1]。黄芩中黄酮类化合物为主要有效成分，含量较高的成分有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素，主要黄酮类化合物含量的高低是判别中药黄芩质量优劣的重要依据之一。但如果只研究其个别成分或整体，均有局限性。红外光谱法具有宏观整体鉴定复杂体系的特点及无损快速等优点[2-4];高效液相色谱法能分离样品中的物质，并对成分进行定量[5-7]。基于此，本研究采用加速试验法观察黄芩的贮藏稳定性，红外光谱法和高效液相色谱法分析了黄芩药材的整体变化及4种黄酮类化合物含量的变化，以期能全面、有效、合理的评价并控制不同贮藏期黄芩的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Spectrum GX FTIR光谱仪(PerkinElmer)，DTGS检测器，光谱范围4000-400/cm，分辨率4/cm，扫描累加次数32次;CKW-Ⅱ温控仪(北京朝阳自动仪表厂);Agilent 1200 Series高效液相色谱仪。

1.2 试药 黄芩苷对照品(批号:715-9506)、黄芩素对照品(批号:111595-200604)、汉黄芩素对照品(批号:111514-200403)均购自中国药品生物制品检定所;汉黄芩苷对照品(批号:20090319)，购自上海顺勃生物工程技术有限公司。黄芩药材采自内蒙古赤峰地区，由中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室周世良研究员鉴定为正品黄芩。将黄芩药材分为四批，置于湿度为70%、温度为37℃的恒温箱内，分别于0、1、2、3个月取样测定。

2 方法

2.1 红外光谱法 黄芩药材粉碎，过200目筛，取2-3mg过筛后的样品粉末与200mg溴化钾于玛瑙研钵中磨细混匀，压片，傅里叶红外光谱仪进行测试。根据红外光谱图的特点，选择2000/cm和400/cm为光谱基线起止点，计算特征峰的高度比。再将所压样品装入变温附件，以2℃/min的升温速度加热，50-120℃，每隔10℃测试样品的红外光谱，计算，得到在热微扰下样品的二维相关红外光谱。

2.2 高效液相色谱法 色谱柱为Agilent XDB-C18柱(2.1mm×150mm，3.5μ m);流 动 相 为 1%冰 醋 酸-水(A)和乙腈(B),梯度洗脱,洗脱程序如下:0-5min，21%B;5-12min,21%-22%B;12-30min,22%-30%B;30-60min,30%-60%B;流速0.2ml/min;检测波长276nm;进样量 2μ l。

2.3 对照品溶液的制备 精密称量黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，甲醇溶解，制成每1ml中含黄芩苷1.81mg、汉黄芩苷0.27mg、黄芩素0.25mg、汉黄芩素0.13mg的对照品溶液，0.45 μ m微孔滤膜过滤。

2.4 供试品溶液的制备 精密称量黄芩粉末0.2525g置平底烧瓶中，精密量取溶剂(水:乙醇:乙酸乙酯:冰醋酸=50:49:5:1)25ml,加热回流90min，静置，过0.45μm微孔滤膜，待用。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验:取按2.4的方法制备供试品溶液(0个月)，连续进样6次，测定峰面积。按2.2的色谱条件测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的RSD＜2.41%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验:取同一供试品溶液(0个月)，按2.4的方法制备5份供试液，按2.2的色谱条件测定，测得各主要色谱峰相对峰面积的RSD＜2.56%，表明实验重复性良好。

2.5.3 稳定性试验:取同一供试品溶液(0个月)，分别于0、2、8、16、24h按2.2的色谱条件测定，测得各主要峰相对峰面积的RSD＜2.68%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.5.4 线性关系考察:将2.3中的对照品溶液采用倍比稀释法成系列浓度，分别取2 μ l进样，记录色谱峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

表1 4种化合物的回归方程、相关系数和线性范围

2.6 样品含量测定 精密称取各贮藏期的黄芩药材0.25g，按2.4的方法制成供试品溶液，2μ l进样，平行测定3次，计算各样品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量。

3 结果

3.1 黄芩的红外光谱分析 黄芩的主要黄酮类化合物为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等。红外光谱结果显示:①贮藏0个月、1个月黄芩的1614/cm峰很强。②贮藏2个月黄芩1659/cm、1508/cm峰较强，1614/cm峰弱;1412/cm、1358/cm、1294/cm吸收峰均随贮藏时间的推移而向高波数移动，说明黄酮类成分已开始改变。③贮藏3个月黄芩在1700-1200/cm波段只有1630/cm和1450/cm两个峰，无1658、1614、1451、1412、1358和1294/cm吸收峰，可能是黄芩中有效成分黄酮类成分已酸变成其它成分;1069/cm附近的大宽峰强度变化十分明显，说明在贮藏过程中，糖(苷)类物质逐渐降解、含量减少。用红外光谱阵列相关系数比对软件得到贮藏0、1、2和3个月黄芩的相关系数分别为1、0.9670、0.8570和0.7308，说明黄芩贮藏过程中黄酮类的成分和含量均发生明显变化。

3.2 黄芩的高效液相色谱分析 加速试验法不同贮藏期黄芩中四种黄酮类化合物含量见表2。在贮藏0-3个月的过程中黄芩苷和汉黄芩苷的含量明显降低，分别由126.74mg/g、24.26mg/g降 低 到1.09mg/g和0.53mg/g;而黄芩素和汉黄芩素的含量是先增加后减少。说明黄芩贮藏过程中4种黄酮类化合物的含量发生了明显变化，即贮藏时间对黄芩的质量有明显影响。

表2 加速试验法不同贮藏期黄芩中4种黄酮类化合物的含量

4 讨论

中药研究中稳定性试验结果以常温稳定试验的结果为准。但是在常温下考核试验费时较长，不能及时掌握药品质量变化的速度和规律，也不易及时发现和纠正影响药品质量稳定性的条件和因素，本研究采用的恒温恒湿加速试验法研究黄芩的贮藏稳定性，在较短时间内预测了黄芩在常温条件下的质量稳定性，大大缩短了实验时间。

红外光谱法测定结果从宏观上反映了黄芩中黄酮类和糖类物质随贮藏时间的延长而降低，高效液相色谱法测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种黄酮类物质的含量均有下降趋势。因此，本研究表明，黄芩药材随贮藏时间的延长有效成分含量降低，因此提示，在实际工作中应有效控制黄芩药材的贮藏期。

[1] 赵胜男,李守拙.不同采收期黄芩中黄酮类成分含量比例的研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(11):86-88.

[2] Xu C,Wang Y,Chen J,et al. Infrared macro- fingerprint analysisthrough-separation for holographic chemical characterization of herbal medicine [J].J Pharm Biomed Anal, 2013, 74: 298-307.

[3] 武晓丹，金哲雄，孙素琴，等.七种不同产地仙鹤草原药材及提取物的红外光谱与二维相关红外光谱的分析与鉴定[J].光谱学与光谱分析，2010，30(12):3222-3227.

[4] 刘素丽，陈建波，周群，等.黄芩采收季节的红外光谱三级鉴别与主成分分析[J].光谱学与光谱分析，2012，32(10):2669-2673.

[5] 丁芳林，张雯杰，陈波，等.HPLC测定不同产地黄芩中黄酮化合物的含量[J].中国现代中药，2008，10(7):25-27.

[6] 吴毅，吴良发，许娇，等.HPLC法同时测定蜂胶软胶囊中8种黄酮的含量[J].中药材，2013，36(2):314-316.

[7] 张箭，肖丽和，李发美.RP-HPLC法测定黄芩属四种药材中五个活性成分的含量[J].中药材，2005，28(5):389-391.