黑龙江省部分地区马铃薯Y病毒株系检测

刘洪义，梁五生，刘忠梅，张洪祥，杨立群

（1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，国家马铃薯病毒检测重点实验室，哈尔滨 150001；

2.浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室，杭州 310058）

黑龙江省部分地区马铃薯Y病毒株系检测

刘洪义1，梁五生2，刘忠梅1，张洪祥1，杨立群1

（1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，国家马铃薯病毒检测重点实验室，哈尔滨 150001；

2.浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室，杭州 310058）

从黑龙江省克山、讷河、五大连池和北安大田种植的马铃薯上采集马铃薯病叶，提取总RNA，利用之前验证过的引物，进行反转录、PCR扩增，以及焦磷酸测序，以鉴定感染的马铃薯Y病毒（PVY）株系。结果表明，克山有2个样品分别感染PVYN:O和PVYN-Wi；讷河有2个样品感染PVYN-Wi；五大连池有2个样品分别感染PVYN:O和PVYN-Wi；北安有1个样品感染PVYN-Wi。结合之前报道的9份黑龙江省马铃薯病样的PVY株系鉴定结果，表明黑龙江省大田种植的马铃薯至少存在PVYN-Wi、PVYN:O、PVYNTN和PVYN4种PVY株系侵染；而且，由于PVYN-Wi侵染了16份已鉴定病样中的7份，而其余3种株系均仅侵染3份病样，显示PVYN-Wi可能为优势株系。

黑龙江省；马铃薯；马铃薯Y病毒；病毒株系鉴定；焦磷酸测序

马铃薯是中国第四大粮食作物，粮菜饲兼用，加工用途多，产业链条长。发展马铃薯产业对于确保我国粮食安全、促进农民增收、振兴农村经济具有重要意义[1-2]。黑龙江省日照充足，昼夜温差大，土壤多为黑土，适合马铃薯生长。黑龙江省属于我国种植马铃薯的优势省份之一[3]。在马铃薯生长过程中，常受到各种病原侵害[4-7]，其中，马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）对马铃薯产量和品质影响较大[8-11]。PVY是一种RNA病毒，是具有重大病害影响的十大植物病毒之一[12]。根据其病理效应，PVY可分为O、N、C、Z、E等多个不同类群，其中类群N又可分为PVYN、PVYNTN、PVYN-Wi等多个株系[9,13]。株系PVYO可引起携带Ny基因的马铃薯发生过敏反应，PVYC可引起携带Nc基因的马铃薯发生过敏反应，而PVYNTN可导致马铃薯发生马铃薯块茎坏死环斑病（Potato tuber necrotic ringspot disease，PTNRD）[8]。鉴于上述不同的病理效应，不同PVY株系的危害程度有所差异[9-10]，检测大田马铃薯感染的PVY株系情况，可为马铃薯检验检疫提供技术依据，推动马铃薯种薯认证相关法规的完善和种薯检测工作，指导选择栽培合适的马铃薯品种，选用恰当的脱毒防治技术[14-15]。

目前国内已开展一些马铃薯感染的PVY株系的鉴定工作[16-24]，但采样地点的覆盖面仍不广，样品数较为有限，比如黑龙江省迄今仅鉴定9份马铃薯病样（见表1），其中包括1份克山样品和1份讷河样品的鉴定结果[24]。前期试验对这2份病样的鉴定利用焦磷酸测序技术已完成，这也是首次报道将焦磷酸测序技术运用于PVY株系鉴定。本文利用焦磷酸测序技术对采自黑龙江4个不同地区的16份马铃薯样品的PVY株系进行鉴定，以期进一步了解黑龙江省乃至全国范围内大田种植的马铃薯感染的PVY株系情况。

表1 黑龙江省内部分地区马铃薯感染PVY株系的鉴定结果Table 1 Potato virus Y strains previously identified in references with potato plant samples from different places of Heilongjiang Province in China

1 材料与方法

1.1 植物材料

分别从黑龙江省克山县采集马铃薯潜在病叶样品24份，从讷河市采集样品18份，从五大连池市采集样品7份，从北安市采集样品7份。已通过焦磷酸测序证实从克山县和讷河市采集的2份样品感染了PVYN-Wi[24]。本文从剩余样品中，每个地区挑选4份发病症状尤其明显样品，鉴定可能感染的PVY株系。

1.2 反转录引物、PCR引物和测序引物的设计

之前从NCBI库中选取代表PVYC、PVYO、PVYN、PVYNTN、PVYNTN-NW、PVYN∶O、PVYN-Wi、PVYWilga、PVYN（W）9个株系的PVY全基因组序列30个，比对P1和CP蛋白的氨基酸序列，分别找出1个差异区段，然后找出其在基因组中的序列，针对这2个区域设计反转录引物（R001、R008）、PCR引物（P1-A-F1、P1-A-R-biotin、CP-B-F1和CPB-R-biotin）和测序引物（P1-A-F1，CP-B-F1），经研究证实可用于焦磷酸测序法鉴定马铃薯感染的PVY株系[24]。本研究利用之前设计的反转录引物、PCR引物和测序引物，具体序列参见文献[24]。所用引物均由Invitrogen公司合成。

1.3 总RNA的提取

具体操作参见文献[24]，取马铃薯叶片样品，加液氮，磨碎，用QIAGEN的RNeasyRPlant Mini Kit提取总RNA，Nanodrop紫外分光光度计（ND1000）测定RNA样品浓度。

1.4 反转录

具体操作参见文献[24]，取提取的RNA样品，用Invitrogen的GoldScript cDNA Synthesis Kit进行反转录，操作按说明书进行。

1.5 PCR扩增

具体操作参见文献[24]，取反转录产物，用Invitrogen公司的PCR SuperMix配制PCR反应混合液置于Eppendorf梯度PCR仪（型号：MastercyclerRep）中进行PCR扩增。反转录引物R001的反转录产物用PCR引物P1-A-F1和P1-A-R-biotin进行PCR扩增。反转录引物R008的反转录产物用PCR引物CP-B-F1和CP-B-R-biotin进行PCR扩增。每管PCR反应混合液含45 μL PCR SuperMix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，3 μL反转录产物，总体积为50 μL。PCR程序为：95℃×5 min，45个扩增循环（95℃×15 s，63℃×30 s，72℃×18 s），72℃× 5 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。63℃下退火有PCR产物但条带模糊的样品提高退火温度继续PCR以提高特异性。出现清晰条带且长度符合预期的PCR产物才用于焦磷酸测序。

1.6 焦磷酸测序

测序所用试剂均购自QIAGEN公司。具体操作参见文献[24]，每份PCR产物吸取5 μL加入酶标板，每孔加入40 μLBinding buffer和1 μL磁珠，室温振摇约10 min，按仪器说明书程序抓取单链PCR模板。将得到的单链PCR模板放入已每孔加有40 μL Annealing buffer和1 μL测序引物（浓度为100 μmol·L-1）的测序板中，置于烘箱中85℃孵育2 min，取出自然冷却至室温后放入测序仪（PyroMark ID型焦磷酸测序仪，德国QIAGEN公司），按测序软件计算得出的体积数值将酶混合物、底物混合物和4种dNTP加入试剂舱的指定腔室中，然后启动程序进行焦磷酸自动测序。PCR引物P1-A-F1和P1-A-R-biotin进行PCR扩增的产物用测序引物P1-A-F1进行测序。PCR引物CP-B-F1和CP-B-R-biotin进行PCR扩增的产物用测序引物CP-B-F1进行测序。利用测序结果进行PVY株系判定的方法参见文献[24]。

2 结果与分析

2.1 测序模板的获取

由于PVY的基因组是1条单链RNA，因此需要提取RNA进行反转录，并进一步进行PCR扩增来获得测序模板。本试验中利用反转录引物R001结合PCR引物P1-A-F1和P1-A-R-biotin获取P1蛋白的部分编码区，PCR产物预期长度为197 bp；利用反转录引物R008结合PCR引物CP-B-F1和CP-B-R-biotin来获取CP蛋白的部分编码区，PCR产物预期长度为200 bp。图1显示退火温度为63℃下的PCR结果。在预期长度位置有PCR产物但条带模糊的样品（如图1中用虚线箭头指示的1、2、6和15泳道）继续提高退火温度来PCR以提高特异性（因限于篇幅，进一步PCR的结果图未展示）。出现清晰条带且长度符合预期的PCR产物（如图1中用实线箭头指示的3、7、9、12、13和14泳道）用于焦磷酸测序。

2.2 焦磷酸测序结果

利用PCR扩增获取的测序模板进行焦磷酸测序。样品BA-003的焦磷酸测序图见图2。

图2中A为PCR引物P1-A-F1和P1-A-R-biotin进行PCR扩增的产物用测序引物P1-A-F1进行测序的结果，B为PCR引物CP-B-F1和CP-B-R-biotin进行PCR扩增的产物用测序引物CP-B-F1进行测序的结果。

2.3 根据焦磷酸测序结果判定PVY株系

根据焦磷酸测序结果判定，克山1份样品感染了PVYN:O，1份样品感染PVYN-Wi；讷河2份样品均感染PVYN-Wi；五大连池1份样品感染PVYN:O，1份样品感染PVYN-Wi；北安1份样品感染PVYN-Wi（见表2）。这7份样品照片见图3，主要症状描述见表2。

图1 部分测序模板的PCR结果Fig.1 PCR results for some sequencing templates

图2 样品BA-003的焦磷酸测序Fig.2 Pyrosequencing figures of the sample BA-003

表2 对黑龙江省的部分地区马铃薯样品所感染的PVY株系的鉴定结果Table 2 PVY strains identified in this research in the potato leaf samples collected from some places of Heilongjiang Province

图3 鉴定了PVY株系的7份马铃薯样品的田间采样Fig.3 Photos of the seven potato plant samples of this research with identified PVY strains in the fields where they were collected

3 讨论与结论

利用焦磷酸测序技术从采自黑龙江省的克山、讷河、五大连池和北安地区的5份马铃薯样品中鉴定出PVYN-Wi，从采自克山和五大连池的2份样品中鉴定出PVYN:O。之前我们曾报道分别从1份克山样品和1份讷河样品中鉴定PVYN-Wi[24]。另有文献报道从克山等地的3份马铃薯样品中鉴定出PVYNTN[20-22]，从哈尔滨、牡丹江和集贤3份样品中鉴定出PVYN[16,18]，从哈尔滨的1份样品中鉴定出PVYN:O[23]。鉴定结果表明黑龙江省内大田种植的马铃薯至少存在PVYN-Wi、PVYN:O、PVYNTN和PVYN这4种PVY株系侵染；而且，由于PVYN-Wi侵染了16份已鉴定病样中的7份，而其余3种株系均仅侵染了3份病样（表1、2），显示PVYN-Wi可能为优势株系。

研究人员从山东省和安徽省的马铃薯样品中鉴定出PVYO[17，19]，从河南省的马铃薯样品中鉴定出PVYNW[21]，从河南省、贵州省和山西省的马铃薯样品中鉴定出PVYN:O[21-22]。比较黑龙江省和黑龙江省外地区马铃薯样品感染PVY株系的鉴定结果，显示黑龙江省和黑龙江省外地区马铃薯感染的PVY株系既有相同（PVYN:O），也有不同（PVYO、PVYNW）。此外，本文和上述文献报道的鉴定结果表明，我国大陆地区种植的马铃薯至少存在PVYN-Wi、PVYN:O、PVYNTN、PVYN、PVYO和PVYNW这6种PVY株系侵染。

之前曾报道两份均感染了PVYN-Wi的马铃薯病样的症状之间有明显差异[24]，其他报道我国大陆地区PVY株系的文献中鲜有马铃薯感染不同PVY株系后的症状描述[16-23]。本试验中5份均感染PVYN-Wi的马铃薯病样（KS-GB-002、NH-CF-001、NH-CF-004、WDLC-007、BA-003），以及2份均感染PVYN:O的马铃薯病样（KS-BH-002、WDLC-003）的症状之间有明显差异（见图3），再次表明仅从马铃薯病叶的症状来判断所感染的PVY株系非常困难。

Ogawa等研究显示日本的马铃薯至少存在PVYNTN、PVYO和PVYN3种PVY株系侵染[25]；Lorenzen等研究显示美国的马铃薯至少存在PVYN、PVYNTN、PVYN:O3种PVY株系侵染[26]；而Nanayakkara等研究显示加拿大的马铃薯也至少存在PVYN、PVYN:O和PVYNTN3种PVY株系侵染[27]。上述国家检出的PVY株系在我国均有检出[17,19,21]。由于缺乏全基因组数据，尚无法判断我国PVY株系与国外PVY株系之间的亲缘关系。但是，Ogawa等对日本的PVY与其他国家相同株系PVY的全序列比较结果显示，仍有一定的序列差别[25]，而PVY具有较强的重组能力[9]，外来序列有可能促进本土PVY重组出新的株系，因此加强PVY检疫工作仍很有必要。

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Identification ofPotato virusY strains in infected potato plants from some places of Heilongjiang Province

LIU Hongyi1,LIANG Wusheng2,LIU Zhongmei1, ZHANG Hongxiang1,YANG Liqun1
(1.State Key Testing Laboratory of Potato Viruses of China,Technical Center of Inspection and Quarantine,Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Harbin 150001,China;2.State Key Laboratory of Rice Biology,Institute of Biotechnology,School of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Some potato plant samples potentially infected byPotato virus Y(PVY)were collected from the fields in Keshan,Nehe,Wudalianchi and Beian of Heilongjiang Province,China.Total RNA was extracted from the leaves of the samples.Reverse transcription,PCR and pyrosequencing were carried out with the primers designed and testified previously to identify the PVY strains in the samples. The sequencing results indicated that two samples from Keshan were infected by PVYN:Oand PVYN-Wi, respectively;two samples from Nehe both were infected by PVYN-Wi;two samples from Wudalianchi were infected by PVYN:Oand PVYN-Wi,respectively;and one sample from Beian was infected by PVYN-Wi. Taken together with the PVY strains previously identified from nine potato plant samples collected from Heilongjiang Province,the research results indicated that potato plants in Heilongjiang Province had been infected by at least four PVY strains(PVYN-Wi,PVYN:O,PVYNTNand PVYN).Furthermore,as PVYN-Wiwas detected in seven of the 16 identified samples,but each of the three rest strains was only detected in three identified samples,respectively,and PVYN-Wiwas probably the predominant one of the four strains.

Heilongjiang Province;potato;Potato virus Y;virus strain identification;pyrosequencing

S532

A

1005-9369（2014）01-0047-06

2013-10-09

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2008IK242）；国家自然科学基金资助项目（30870187）

刘洪义（1966-），男，研究员，硕士，研究方向为植物检疫。E-mail:liuhongyi665@163.com

时间2014-1-9 21:10:34[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2110.011.html

刘洪义,梁五生,刘忠梅,等.黑龙江省部分地区马铃薯Y病毒株系检测[J].东北农业大学学报,2014,45(1):47-52.

Liu Hongyi,Liang Wusheng,Liu Zhongmei,et al.Identification ofPotato virus Ystrains in infected potato plants from some places of Heilongjiang Province[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):47-52.(in Chinese with English abstract)