两种作图方法定位寒地粳稻9个重要农艺性状QTL

郑洪亮，赵宏伟，王敬国，刘化龙，邹德堂*，刘乘铭

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.哈尔滨乘贝科技开发有限公司，哈尔滨 150001）

两种作图方法定位寒地粳稻9个重要农艺性状QTL

郑洪亮1，赵宏伟1，王敬国1，刘化龙1，邹德堂1*，刘乘铭2

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.哈尔滨乘贝科技开发有限公司，哈尔滨 150001）

以黑龙江省主栽粳稻品种东农422和空育131为亲本配置杂交组合，经繁殖加代建立由180个F3株系组成的F2:3群体，构建含75个SSR标记的遗传连锁图谱，采用WinQTL Cartographer Ver.2.5的复合区间作图法（CIM）和IciMapping Ver.3.1的完备区间作图法（ICIM）对抽穗天数、株高、有效穗数、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗总粒数、每穗实粒数和单株产量等9个农艺性状进行QTL定位分析。结果表明，CIM法和ICIM法在水稻全基因组内共检测到33和38个QTL，2种方法重复检测到的QTL有27个，其中控制抽穗天数、株高、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗总粒数、每穗实粒数和单株产量的QTL各为5，4，2，3，3，5，4，1个，且与已报道的QTL具有较好一致性。另外发现9个QTL成簇分布的热点区域，且与性状间的相关性具有高度一致性。研究结果对水稻农艺性状相关分子标记利用和改良水稻产量研究具有重要意义。

寒地粳稻；农艺性状；SSR；QTL；复合区间作图法；完备区间作图

水稻主要农艺性状，如抽穗期、株高、穗长等都是由多基因控制数量性状[1]，其表现很大程度上受环境影响，采用传统的数量遗传学方法对性状进行改良，效率较低，只能借助统计手段，将控制农艺性状的多基因系统作为一个整体研究，无法了解控制某个性状的单个基因位置和效应，制约人们在育种中对数量性状的遗传操纵能力。随着分子标记的大量开发，通过分子标记连锁图的构建和遗传统计模型，可以对基因组区段分析进行QTL定位。近年来，水稻重要农艺性状都进行了QTL定位[3-5]，为基因克隆和分子标记辅助育种奠定基础。前人研究多数使用籼粳交，而对于粳粳交的研究较少，对于寒地粳稻基因的遗传定位更少有报道。另外，不同研究者由于所用作图群体、分子标记、试验环境和计算方法等不同，研究结果差异较大[6]，即使对同一组数据采用不同的计算模型计算结果也不尽相同[7]。

本试验以东农422和空育131杂交后获得的F2∶3代180个株系为试验材料，采用CIM法和ICIM法两种作图方法对9个重要农艺性状进行QTL定位，对两种不同分析方法的结果进行比较，并将定位结果与前人研究进行比较分析，以期获得更为精确、稳定的QTL位点，为QTL作图方法的运用提供理论依据，也为分子标记辅助育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以东农422为母本，空育131为父本，2009年配制杂交组合东农422/空育131，获得F1种子，经繁殖加代获得180个F2∶3株系。东农422由东北农业大学农学院培育并提供，空育131原产于日本，由黑龙江省农垦科学院水稻研究所从吉林农科院引进并选育而成。

1.2 田间种植和性状考查

2011年将试验材料种植于东北农业大学香坊试验实习基地。4月18日播种，5月25号移栽。随机区组设计，单行区，每行种植50株，3次重复。栽培管理同一般田间生产。在抽穗期调查记载每个株系的抽穗日期，并计算从播种到抽穗所需的抽穗天数（HD），成熟时每小区取中间5株进行考查。考查性状包括株高（PH）、有效穗数（PN）、穗长（PL）、一次枝梗数（PBN）、二次枝梗数（SBN）、每穗总粒数（SP）、每穗实粒数（FGP）和单株产量（GWP）。记载和考种按中国稻种资源评价标准[8]进行，每个性状取平均值用于数据分析。

1.3 DNA提取和PCR扩增

在分蘖盛期对东农422和空育131及其杂交组合的F2代180个个体进行叶片取样，放置于-80℃超低温冰箱中备用，按照黄萱等[9]并稍有改进的CTAB法提取DNA，0.8%琼脂糖凝胶中电泳40 min，利用凝胶成像仪观察、统计DNA浓度，并用ddH2O进行DNA稀释。PCR反应总体积为20 μL，体系包括3 μL的模板DNA（25 ng·μL-1），2 μL 10× PCR缓冲液，1.5 μL MgCl2（25 mmol·L-1），2 μL SSR引物（12 ng·μL-1），0.2 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.3 μL Taq酶（5 U·μL-1），ddH2O补足至20 μL，最后加入液体石蜡覆盖体系（以上操作均在冰盒上进行）。PCR扩增条件为94℃预变性6 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃延伸5 min，4℃保存。扩增结果采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测。

1.4 遗传连锁图谱的构建及QTL分析

参照www.gramene.org中的引物数据，选择均匀分布于水稻12条染色体上的SSR标记600对，委托上海生工生物工程有限公司合成。经过东农422和空育131两个亲本的多态性分析，检测到多态性引物105对，多态性频率为17.50%，利用筛选出的引物对F2代180个单株的DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行统计，选择多态性好且扩增效果较好的88对SSR标记，应用Mapmaker/Exp 3.0b软件构建分子标记连锁图谱，剔除13个偏分离严重且对图谱影响较大的标记，其中第10条染色体由于多态性标记太少而无法构建遗传连锁图，其余11条染色体均可构建遗传连锁图，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距（cM），构建的连锁图谱共包含75个SSR标记，总共覆盖水稻基因组约1 457.68 cM，标记间平均距离为19.43 cM。利用Mapchart 2.2进行遗传连锁图谱绘制。

利用WinQTLCart 2.5的复合区间作图法（CIM）以及QTL IciMapping v3.1的完备区间作图法（ICIM）进行QTL定位，两种方法均取LOD=2.5为QTL的阈值。QTL的命名原则遵循McCouch等提出的方法[10]。

2 结果与分析

2.1 亲本及群体主要农艺性状表型变异

亲本及其F3株系的9个农艺性状的表型值见表1。两亲本经t-检验除有效穗数未达显著差异外，其余性状均达显著或极显著差异。其中，抽穗天数、株高、穗长、一次枝梗数、每穗总粒数、每穗实粒数和单株产量等7个性状东农422的均值较高，而有效穗数和二次枝梗数空育131表现为高值亲本。9个性状在F3株系中均表现出超亲分离现象，平均值介于双亲之间，对数据进行正态分布的适合性检验分析，其偏斜度和峰值的绝对值均小于1，表明所有性状均呈近似正态分布，呈典型的数量性状遗传模式，适合QTL定位。

2.2 农艺性状相关分析

F2∶3群体中主要农艺性状间的相关分析结果见表2。从表中可以看出，单株产量、抽穗天数、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗总粒数及每穗实粒数彼此间呈显著或极显著正相关；株高与穗长、一次枝梗数及二次枝梗数呈极显著正相关；有效穗数与每穗总粒数和每穗实粒数呈极显著负相关，与其他性状相关性不显著。

表1 亲本及F3株系9个农艺性状的表型分析Table 1 Phenotypic analysis of nine traits in two parents and their F3lines

表2 F2：3群体中9个农艺性状间的相关关系Table 2 Correlation coefficient among nine agronomic traits in F2：3population

2.3 农艺性状QTL检测与分析

以构建的含有75个SSR标记的遗传连锁图谱为基础，结合F3株系的农艺性状的表型数据，采用WinQTLCart 2.5的CIM法和QTL IciMapping v3.1的ICIM法对水稻9个主要农艺性状进行QTL分析。结果表明，各性状利用CIM法共检测到33个QTL，分布于第1、2、4、7、11和12染色体上，LOD值在2.51～17.31之间，贡献率变幅为4.0%～28.0%；利用ICIM法共检测到38个QTL，分布于第1、2、4、5、6、7、11和12染色体上，LOD值在2.53～18.98之间，贡献率变幅为3.26%～35.20%。结果见表3和图1。可将各性状检测出的QTL分为3类，第1类为仅在CIM法中检测出的QTL；第2类为仅在ICIM法中检测出的QTL；第3类为2种作图方法均能检测出的QTL。具体结果如下：

①抽穗天数：检测到第1类QTL 1个（qHD-12），贡献率为24.0%，其增效等位基因来源于东农422，可使抽穗天数延迟5.23 d；检测到第2类QTL 1个（qHD-5），其贡献率较小（5.49%），增效等位基因来自空育131；检测到第3类QTL 5个（qHD-2、qHD-7-1、qHD-7-2、qHD-7-3、qHD-12），除qHD-2的增效等位基因来自空育131外，其余4个QTL的增效等位基因均来自东农422。

②株高：没有检测到第1类QTL；检测到第2类QTL 1个（qPH-2），其增效等位基因来自空育131；检测到第3类QTL 4个（qPH-1、qPH-5、qPH-7-1、qPH-7-2），其中qPH-1和qPH-5的增效等位基因来自空育131，qPH-7-1和qPH-7-2的增效等位基因来自东农422。

③有效穗数：检测到第1类QTL 2个（qPN-2-1、qPN-2-2），其中qPN-2-1的增效等位基因来自东农422，qPN-2-2的增效等位基因来自空育131；检测到第2类QTL 1个（qPN-7），其增效等位基因来自东农422；没有检测到第3类QTL。

④穗长：没有检测到第1类QTL；检测到第2类QTL 1个（qPL-5），其贡献率较小（5.89%），增效等位基因来自空育131；检测到第3类QTL 2个（qPL-4、qPL-7），其中qPL-7的贡献率较大，2种作图方法中分别为22.0%和18.68%，2个QTL的增效等位基因均来自东农422。

⑤一次枝梗数：检测到第1类QTL 1个（qPBN-4），其贡献率较小，为5.0%，增效等位基因来自空育131；检测到第2类QTL 1个（qPBN-6），贡献率为14.96%，其增效等位基因来自东农422；检测到第3类QTL 3个（qPBN-2、qPBN-7-1、qPBN-7-2），其中qPBN-2的增效等位基因来自空育131，另外2个QTL的增效等位基因来自东农422。

⑥二次枝梗数：没有检测到第1类QTL；检测到第2类QTL 1个（qSBN-2-2），贡献率较小（5.07%），其增效等位基因来自空育131；检测到第3类QTL 3个（qSBN-2-1、qSBN-7-1、qSBN-7-7），其中qSBN-2-1的增效等位基因来自东农422，另外2个QTL的增效等位基因均来自空育131。

⑦每穗总粒数：没有检测到第1类QTL；检测第2类QTL 1个（qSP-5），贡献率较小（6.06%），其增效等位基因来自空育131；检测到第3类QTL 5个（qSP-2、qSP-4、qSP-7-1、qSP-7-2、qSP-12），其中qSP-2和qSP-4的增效等位基因来自空育131，另外3个QTL的增效等位基因来自东农422。

⑧每穗实粒数：检测到第1类QTL 1个（qFGP-12），其增效等位基因来自东农422；检测到第2类QTL 1个（qFGP-5），其增效等位基因来自空育131；检测到第3类QTL 4个（qFGP-2、qFGP-4、qFGP-7-1、qFGP-7-2），其中qFGP-2和qFGP-4的增效等位基因来自空育131，qFGP-7-1和qFGP-7-2的增效等位基因来自东农422。

⑨单株产量：检测到第1类QTL 1个（qGWP-2），其贡献率较小（6.0%），增效等位基因来自空育131；检测到第2类QTL 3个（qGWP-5、qGWP-7-2、qGWP-12），其中只有qGWP-5的增效等位基因来自空育131；检测到第3类QTL 1个（qGWP-7-1），其增效等位基因来自东农422。

表3 寒地粳稻F2：3群体主要农艺性状QTL定位结果Table 3 QTL mapping of main agronomic traits in F2：3population of japonica rice in cold

续表

图1 9个农艺性状QTL在遗传图谱上的位置Fig.1 Location of QTLs for nine agronomic traits in the genetic map

3 讨论

本研究利用CIM法和ICIM法分别检测到33个和38个与农艺性状有关的QTL，初步认为ICIM法的发现能力强于CIM法，但两种方法所检测QTL的真实性还需进行重复验证，不能仅凭发现QTL的个数认定ICIM法强于CIM法，由于本研究所用作图群体为F2分离群体，无法进行重复验证，下一步将构建重组自交系或回交群体进行多年多点验证。

利用单一方法检测到的QTL不够详细，在检测中可能会漏掉部分QTL或定位的QTL不精确，郭援等利用秀水79×C堡的254个重组自交系在两种环境下对主茎剑叶卷曲度进行考查[11]，并利用WinQTLCart 2.5和QTLNetwork 2.0两种软件进行QTL分析，发现两种分析方法重复检测到的QTL与已报道的相关QTL有较高一致性，说明利用两种方法检测到的QTL具有更高精确性和可靠性。本研究利用CIM法和ICIM法在水稻全基因组内各检测到33个和38个QTL，其中仅用1种方法检测到的QTL分别为6个和11个，其贡献率均较小，为微效QTL，可根据下一步的研究目标进行取舍：如果研究目标是根据作图结果构建次级群体进行精细定位、克隆，进而进行转基因工作，则要舍弃贡献率较小、可靠性较低的QTL，保证后续工作的顺利进行；如果研究目标是利用分子标记辅助选择进行聚合育种，则要应用所有检测出的目标性状QTL，保证选择出控制目标性状的所有基因。本研究中利用两种作图方法重复检测到27个QTL，通过相同标记和比较图谱与已报道的相关QTL进行比较分析，发现具有很高的一致性，如本文与郭龙彪[12]将控制抽穗天数的QTL定位在第2、7、11染色体上，且qHD-7-1和qHD-7-2与其定位在相同区间。本研究检测到的与一次枝梗数、二次枝梗数和每穗总粒数有关的QTL，与沈希宏[13]和许凌[14]等研究结果位于相同染色体上。经标记对比发现，与一次枝梗数有关的qPBN-7-2，在本研究与许凌的研究中均与RM214连锁，与二次枝梗数有关的qSBN-7-1，与每穗总粒数有关的qSP-7-1在本研究和沈希宏的研究中位于相同区间，说明这3个QTL在不同的试验材料，不同的环境下均能检测到，稳定性较好。本研究所检测到的QTL主要集中在第2、4、5、7、12染色体上，而在其他染色体上未检测出或检测出很少的QTL，其原因可能是本研究所使用的标记数量较少，染色体标记区间过大，今后需要进一步筛选新的引物并增加图谱上标记的密度，以检测更多QTL。

QTL成簇分布现象在研究中是普遍存在的[15]，在遗传上可能是由一因多效或基因的连锁、基因重叠造成的。许凌等利用重组自交系对水稻的主要农艺性状进行QTL定位分析[14]，结果表明，控制生育期、株高、一次枝梗数和二次枝梗数的QTL在染色体上均有一定的重叠性，相关分析表明，这4个农艺性状之间存在极显著正相关性。一些研究已表明粒长与粒重、粒宽与粒重均呈极显著正相关，其QTL常被定位在相同区域[16]。本研究结果也表明，呈显著或极显著相关的性状间存在相同或紧密连锁的QTL区域，例如，第7条染色体上控制抽穗天数、穗长、一次枝梗数、每穗总粒数、每穗实粒数和单株产量的qHD-7-2、qPL-7-1、qPBN-7-1、qSP-7-1、qFGP-7-1和qGWP-7-1均被定位在RM1306～RM1357区间内，并且6个性状间呈极显著的正相关，RM214～RM1377区间内的qHD-7-3、qPH-7-2、qPBN-7-2、qSBN-7-2、qSP-7-2和qFGP-7-2所控制的抽穗天数、株高、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗总粒数和每穗实粒数也是呈极显著正相关的。欧阳由男指出[17]，综合考虑相关性状进行重要染色体区间的研究，比研究单个性状的QTL更有价值。由于本研究只能进行QTL的初步定位，因此对于上述位于同一区间的QTL，未能判断出究竟是QTL之间存在紧密连锁关系还是同一个QTL的一因多效，需要培育近等基因系进行深入研究和分析。

4 结论

以东农422和空育131及其衍生的F2∶3代180个株系作为试验材料，对寒地粳稻9个重要农艺性状采用CIM法和ICIM法两种方法进行QTL定位分析。QTL检测结果表明，CIM法和ICIM法在水稻全基因组分别检测到33和38个QTL，两种方法重复检测到27个QTL，且与已报道的QTL具有较好的一致性，因此建议两种作图方法共同使用。另外发现9个QTL成簇分布的热点区域，且与性状间的相关性具有高度一致性。研究结果对水稻农艺性状QTL定位研究和分子标记辅助改良水稻产量具有重要应用价值。

[1]田翠,张涛,蒋开锋,等.水稻QTL定位研究进展[J].基因组学与应用生物学,2009,28(3):557-562.

[2]陈四清,王金勇,范首君,等.对数量遗传学的几点思考[J].畜禽业,2003(10):20-21.

[3]关家胜,周鸿凯,陈国波,等.水稻单穗重和千粒重的QTL分析[J].中国水稻科学,2008,22(2):143-147.

[4]Yagi T,Nagata K,Fukuta Y,et al.QTL mapping of spikelet number in rice(Oryza sativaL.)[J].Breeding Science,2001,51(l): 53-56.

[5]严长杰,陈峰,严松,等.利用DH群体分析水稻产量与蒸煮品质的遗传相关性[J].作物学报,2007,33(3):363-369.

[6]张志勇,黄育民,张凯,等.水稻株高QTL定位及精确性分析[J].厦门大学学报:自然科学版,2008,47(l):116-121.

[7]蒋锋,刘鹏飞,杜世州,等.作物QTL定位方法研究进展[J].安徽农业科学,2009,37(26):12496-12497.

[8]Ying C S.Rice germplasm resources in China[M].Beijing: Chinese Agricultural Sci-Tech Publisher,1993:530-539.

[9]黄萱,高丽美,张永彦,等.一种优化的植物总DNA提取方法[J].西北植物学报,2004,24(6):1103-1106.

[10]McCouch S R,ChoY C,Yano M.Report on QTL nomenclature[J]. RiceGent Newl,1997,14(3):11-13.

[11]郭援,程宝山,洪德林.粳稻SSR连锁图谱的构建及恢复系卷叶性状QTL分析[J].中国水稻科学,2009,23(3):245-251.

[12]郭龙彪,罗利军,邢永忠,等.水稻重要农艺性状的两年QTL剖析[J].中国水稻科学,2003,17(3):211-218.

[13]沈希宏,曹立勇,等．超级杂交稻协优9308重组自交系群体的穗部性状QTL分析[J]．中国水稻科学,2009,23(4):354-362．

[14]许凌.利用重组自交系群体对水稻主要性状的QTL分析[D].南京:南京农业大学,2008.

[15]苏相文．水稻重组自交系产量及其相关性状的QTL分析[D]．雅安:四川农业大学,2010．

[16]Song X J.A QTL for rice gain width and weight encodes a previously unknowRING-type E3 ubiquitin ligase[J].Nat Genet,2007, 39(5):623-630．

[17]欧阳由男．水稻主要农艺性状和叶片发育动态QTL及其与环境（水分）互作效应分析[D]．杭州:浙江大学,2004:72.

QTL Analysis of nine major agronomic traits of japonica rice in cold using two methods

ZHENG Hongliang1,ZHAO Hongwei1,WANG Jingguo1,LIU Hualong1, ZOU Detang1,LIU Chengming2
(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Harbin Chengbei-tech Development Co.,Ltd.,Harbin 150001,China)

An F2:3population was constructed including 180 F3lines,which derived from a cross between two main japonica rice Dongnong422 and Kongyu131,a genetic linkage map was constructed with 75 SSR markers,nine agronomic traits including heading date,plant height,panicle number, panicle length,primary branch number,secondary branch number,total number of spikelets per panicle, numbers of filled grains per panicle and grain yield per plant were detected by using CIM of WinQTL Cartographer Ver.2.5 and ICIM of IciMapping Ver.3.1.The results showed that 33 and 38 QTLs were detected in the rice genome by CIM and ICIM,respectively.27 QTLs were detected in both CIM and ICIM,the number of QTL controlling heading date,plant height,panicle number,panicle length,primary branch number,secondary branch number,total number of spikelets per panicle,numbers of filled grains per panicle and grain yield per plant were 5,4,2,3,3,5,4 and 1,respectively,and they were consisitent with the reported QTL.In addition,nine QTLs clustered distributions of hot regions were found,and highly consistent with the correlation of the traits.The results of the study had importantmeanings for using molecular markers to improve yield of rice.

japonica rice in cold;agronomic trait;SSR;QTL;CIM;ICIM

S511.22

A

1005-9369（2013）10-0034-07

2012-02-25

“十二五”农村领域国家科技计划项目（2011BAD35B02-01）；国家科技支撑项目（2011BAD16B11）

郑洪亮（1987-），男，博士研究生，研究方向为水稻遗传育种。E-mail:zhenghongliang008@126.com

*通讯作者：邹德堂，教授，博士生导师，研究方向为水稻遗传育种。E-mail:zoudt@163.com

时间2014-1-9 20:20:47[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2020.008.html

郑洪亮,赵宏伟,王敬国,等.两种作图方法定位寒地粳稻9个重要农艺性状QTL[J].东北农业大学学报,2014,45(1):34-40.

Zheng Hongliang,Zhao Hongwei,Wang Jingguo,et al.QTL Analysis of nine major agronomic traits of japonica rice in cold using two methods[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):34-40.(in Chinese with English abstract)