GP73在PHC中的表达及临床意义

郑飞+陈学军

【摘要】 目的：探讨GP73在PHC癌组织中的表达及其对PHC可能存在的临床意义。方法：采用逆转录聚合酶链反应和免疫组化检测20例PHC癌组织（PHC组）和18例正常肝组织（正常对照组）中GP73蛋白以及GP73 mRNA的表达情况。结果：PHC组GP73 mRNA的相对表达水平为（1.37±0.18），明显高于对照组的（0.53±0.04）（P<0.05）；PHC组GP73阳性表达率为80.0%（16/20），正常对照组为5.6%（1/18），两组比较差异有统计学意义（P<0.01）；PHC组中GP73蛋白表达量与GP73 mRNA相对表达量存在明显正相关性（r=0.76，P<0.05）。结论：GP73在PHC癌组织中呈高表达，GP73能作为一种有临床意义的肝癌标志物，为PHC的诊断提供可靠的标记。

【关键词】 原发性肝癌； PCR； 免疫组化； GP73； 肿瘤标记物

The Expression of GP73 in Primary Hepatic Carcinoma and Its Clinical Significance/ZHENG Fei，CHEN Xue-jun.//Medical Innovation of China，2014，11（01）：013-014

【Abstract】 Objective：To explore the expression of GP73 in primary hepatic carcinoma and its possible clinical significance to primary hepatic carcinoma. Method： The expression of GP73 protein and mRNA in 20 cases of primary hepatic carcinoma （PHC group） and 18 cases of normal liver （normal control group） were examined by immunohistochemistry and reverse transcription-polymerase chain reaction. Result： The mean level of GP73 mRNA expression in the PHC group was （1.37±0.18）， and significantly higher than the normal control group of （0.53±0.04） （P<0.05）； GP73 protein positive rate of the PHC group was 80.0%， the normal control group was 5.6%， showed significant difference between two groups （P<0.05）； in the PHC group， relative quantity of GP73 protein expression and GP73 mRNA expression had a significantly positive correlation （r=0.76， P<0.05）. Conclusion： GP73 protein is highly expressed in primary hepatic carcinoma， and may serve as a reliable tumor marker for diagnosis of primary hepatic carcinoma with potential clinical significance.

【Key words】 Primary hepatic carcinoma； PCR； IHC； GP73； Tumor marker

First-authors address：Department of Pathology，Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.01.006

原发性肝癌（Primary Hepatic Carcinoma，PHC）为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在肿瘤中高居第五位，死亡率居第三位。研究显示，未接受治疗的PHC患者的5年生存率低于5%，PHC的早期发现对改善患者的生存率和预后扮演着重要的角色。甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein，AFP）为应用最广泛的肝癌肿瘤血清标志物，然而25%～30%的PHC患者血清AFP水平正常，且在慢性肝脏疾病中，例如慢性肝炎和肝硬化，AFP也常呈高水平表达。因此AFP对于PHC的诊断存有一定的不足。GP73是与病毒性肝炎感染、肝细胞恶性转化有关的糖蛋白，对诊断鉴定肝癌上发挥着一定作用。因此本研究借助逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）和免疫组化（Immunohistochemistry，IHC），探究了GP73在PHC的表达及其可能的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年-2012年本院收治的PHC患者20例为PHC组，均符合《中国常见恶性肿瘤诊治规范》的相关诊断标准，术前均未进行放化疗，其中男12例，女8例，年龄30～68岁，平均48.2岁，肝癌标本切下后立刻转移至-80 ℃冰箱中保存待检；同期选取无其他疾病的肝血管瘤患者18例为正常对照组，经病毒学检查确诊无病毒感染，其中男11例，女7例，年龄33～64岁，平均46.5岁，对照肝组织取自肝血管瘤切除术后的瘤旁正常肝组织。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR Trizol法提取组织RNA，Takara逆转录酶试剂盒合成cDNA。GP73上下游引物分别为：5-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3和5-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3；α-tubulin内参的上下游引物分别为：5-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3以及5-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3。PCR扩增条件如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；退火30 s，GP73退火温度为65 ℃，α-tubulin则为57 ℃；72 ℃，1 min；40个循环后，72 ℃维持5 min。电泳后成像，利用Quantity One计算GP73和α-tubulin的A值，GP73 mRNA相对表达量=GP73的A值/α-tubulin的A值。

1.2.2 IHC 组织常规固定脱水后石蜡包埋，制成5 μm切片，脱蜡进水，双氧水浸泡，CB法修复抗原，血清封闭。滴加抗GP73一抗（小鼠抗人GP73多克隆抗体，北京热景生物）并于37 ℃下孵育2 h。PBS洗涤后加入二抗（HRP标记的抗小鼠二抗，北京中杉金桥）并于37 ℃下孵育1 h。PBS洗涤，DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗，吹干封片，镜检。阴性对照中用PBS替代一抗，用已知阳性组织切片充当阳性对照。按照Berry分级法进行IHC半定量分析。

1.3 统计学处理 利用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，采用Spearman相关性分析两个指标间的相关性，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组GP73的表达比较 PHC组切除的肝组织中，GP73阳性表达率为80.0%（16/20），IHC显示GP73主要表达于癌细胞的胞质，呈棕黄色或黄褐色颗粒状染色；正常对照组肝组织中GP73阳性表达率为5.6%（1/18）。两组GP73阳性率比较差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 两组GP73 mRNA相对表达量的比较 RT-PCR结果显示，GP73 mRNA在PHC组肝组织中为高表达，在正常对照组的肝组织中为低表达或不表达；PHC组GP73 mRNA相对表达量为（1.37±0.18），正常对照组为（0.53±0.04），两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 GP73蛋白表达级别与GP73 mRNA相对表达量的相关性分析 采用Spearman相关性分析表明两者存在明显的正相关性（r=0.76，P<0.05）。

3 讨论

近几十年来，PHC为全球范围内高发的10种恶性肿瘤之一，它发病隐匿、进展快、预后差、死亡率高，其死亡率高居第三[1]。及早诊断以及治疗PHC是提高PHC患者生存率的关键所在。然而，现今及早诊断PHC的医学手段主要有影像学以及肿瘤血清标志物（例如传统意义的AFP）筛查。GP73（高尔基体蛋白73）是近年来出现的具有一定潜力新型肝癌肿瘤标志物。在正常肝脏组织中GP73的表达非常低，然而GP73在病变肝细胞中的表达呈现出上升[2-4]。Marrero[5]的研究团队对352例PHC患者的血清标本进行Western Blot检测，他们发现PHC患者血清GP73水平显著高于肝硬化者，GP73早期诊断PHC的敏感度也明显高于AFP，暗示GP73有望成为一种有潜力的新型PHC肿瘤标记物。而后的研究同样也证明GP73诊断PHC的敏感度和特异度均高于AFP[6-8]。

现今对GP73的研究主要聚焦在血清学水平，关于PHC癌组织GP73蛋白表达及其mRNA表达的研究并不多。鉴于此，本研究采用IHC技术，发现PHC癌组织中GP73的阳性表达率高达80.0%，正常肝组织仅为5.6%，两组比较差异具有统计学意义（P<0.01），这一结果与相关研究结果呼应[6，9-10]，说明GP73是较AFP要敏感的PHC肿瘤标记物；此外，凭借RT-PCR技术本研究发现，PHC癌组织中GP73 mRNA相对表达量（1.37±0.18）也高于正常肝组织的（0.53±0.04）（P<0.05），PHC组织中GP73蛋白表达量与GP73 mRNA相对表达量之间存有正相关性（P<0.05），这一结果再次肯定了本研究前面的发现。目前医学界普遍认为细胞恶性转化过程通常伴随着亚细胞器结构及功能的转变，而高尔基细胞器是个亚细胞结构，高尔基体具有很多与信号转导及细胞凋亡相关的蛋白。考虑到上述事实，笔者的研究结果提示高尔基体膜蛋白与肿瘤的发生发展十分相关，并且可能对肿瘤的恶性表型的维持起着十分重要的作用。

总之，本研究的结果证实GP73在PHC癌组织中表达显著升高，提示GP73可以作为一种有临床意义的肝癌标志物，为PHC的诊断提供可靠的蛋白标记。虽然本研究结果表明GP73用于PHC诊断有较好的敏感性，但GP73表达水平与肝癌进展关系则需要深入研究。

参考文献

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（收稿日期：2013-08-05） （本文编辑：蔡元元）

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