野生蓝莓提取物对四种致病菌的抑制作用

姜文洁 ，孙晓红* ，朱 颖，杨 晗，赵 勇，吴启华，潘迎捷

1上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306;2美国缅因大学食品与农业学院，缅因 04469

蓝莓，又名越橘，属于杜鹃花科常绿灌木，果实为深蓝色，外面裹有一层白色的果粉，单果重量在0.5～2.5 g 之间，果肉细腻，酸甜适宜，风味独特，营养价值高，被誉为“水果皇后”，是第三代水果的典型代表。随着人们生活水平的日益提高和保健意识的不断增强，蓝莓作为一种时尚保健水果，逐渐受到广大消费者的青睐。我国的大兴安林、小兴安岭以及长白山地区分布着大量的野生蓝莓，而自上世纪80年代开始，吉林农业大学李亚东教授率先引种蓝莓后，栽培蓝莓的面积也不断扩大，主要分布在我国的长白山、大小兴安岭地区，辽东半岛、胶东半岛地区，长江流域地区以及华南地区。野生蓝莓与人工栽培蓝莓相比，其果实偏小，水分和糖含量较少。野生蓝莓除含有糖、有机酸和维生素C 外，还含有许多其它的营养成分，如有机锗、有机硒、熊果甙、氨基酸、果酸等，是其它植物无可比拟的。此外，野生蓝莓中花青苷色素(花青素、矮青牛配基和甲基花青素等)含量高达3.3～33.8 mg/kg，约是人工栽培品种的5～20 倍［1］。其中花青素是一种生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。美国农业部(USDA)的研究显示，在人们经常食用的40 种蔬菜和水果中，野生蓝莓的抗氧化能力最高［2］。Kristo［3］等人曾经给患有自发性高血压的小鼠喂食添加野生蓝莓的食物，与对照组相比，添加野生蓝莓组的小鼠体内硫酸化粘多糖的含量显著减少，同时野生蓝莓的添加改变了小鼠体内大动脉粘多糖的分布。然而，由于野生蓝莓口感较差及人们对其营养价值的认识匮乏而一直得不到重视，国内针对野生蓝莓的研究也鲜有报道。

近年来，食品安全问题已经成为人们关注的热点话题。由致病菌引起的疾病也逐渐成为食品安全的重要隐患。日常生活中常见的致病菌有很多，如沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、创伤弧菌等食源性致病菌。根据国家卫计委关于2013年第一季度全国食物中毒事件情况的通报，第一季度，微生物性食物中毒事件的中毒人数最多，主要由沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、葡萄球菌肠毒素等引起。因此，采取有效措施控制致病菌的污染显得十分重要。目前，抗生素以及化学保鲜剂是避免致病菌污染的常用方法，抗生素的方法使得这些细菌产生耐药性，化学保鲜剂的安全问题也愈益为人们所担心。Caillet［4］等人研究结果表明，蓝莓提取物对沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌等致病菌均有一定的抑制作用。本研究首次选用中国野生蓝莓为原料，研究其提取物对四种致病菌的抑制作用，为深入研究蓝莓的活性成分，最终开发新型天然无污染的防腐剂奠定了基础，同时也为中国野生蓝莓资源的进一步开发利用提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

野生蓝莓购于哈尔滨高泰食品有限公司，保存于-20 ℃冰箱。铜绿假单胞菌(ATCC27853)、单增李斯特菌 (ATCC19115)、副溶血性弧菌(ATCC33847)购于美国ATCC 菌种保藏中心。金黄色葡萄球菌(AB91093)购自上海疾病预防与控制中心。无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购于北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制备

参考谢庆超等［5］方法。取适量野生蓝莓冻果，微波加热1～2 min，进行快速解冻，然后放入匀浆机中充分搅碎。称取20 g 匀浆至锥形瓶里，加入65%乙醇200 mL，超声波处理25 min，用布氏漏斗过滤，滤液用0.22 μm 的滤膜过滤，取滤液于旋转蒸发仪旋转蒸发，待乙醇挥发完全后，将上清液浓缩至2 g/mL，总体积为10 mL，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 四种菌菌液的制备

取于-80 ℃、25%甘油保存的四种菌种，其中铜绿假单胞菌、单增李斯特菌与金黄色葡萄球菌，分别接种于TSB 液体培养基，副溶血性弧菌接种于3%NaCl 的TSB 液体培养基中;在37 ℃下活化后，划线接种于TSA 琼脂(或3%NaCl 的TSA 琼脂)，挑取单菌落接种于营养肉汤中，在37 ℃下培养至对数期(OD600=0.8)。活化两次后，调整菌悬液的浓度，使其保持106CFU/mL。

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定

参照吕平［6］等人的方法，采用试管二倍稀释法，取11 支无菌试管，向第2 至第11 支试管中加入2 mL TSB;在第1 支试管中加入野生蓝莓提取物原液(2 g/mL)2 mL，在第2 支试管中加入2 mL 的野生蓝莓提取物混匀，混匀后再吸取2 mL 至第3 支试管，如此倍比稀释至到第9 支试管，混匀后吸取2 mL 弃去。第10 支试管为不加蓝莓提取液的生长对照。第11 支试管里加入2 mL 无菌TSB 和2 mL 野生蓝莓提取液，混匀后弃去2 mL。这样第1 支试管至第9 支试管的蓝莓粗提液浓度分别为2000、

1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 mg/mL。向编号为1～10 的10 支试管中加入10 μL四种菌的菌液，37 ℃下培养24 h，观察并记录结果。以肉眼观察，通过与生长对照相比，不发生浑浊变化的最高药物稀释倍数为该药物的MIC 值。实验重复进行3 次。

1.2.4 最小杀菌浓度(MBC)的测定

在试管二倍稀释法测定MIC 的基础上，参照吕平［6］等人的方法，选择所有澄清的试管，将其培养液进行稀释，涂平板，在恒温培养箱中培养24 h，以菌落数不超过5 个的最低蓝莓提取物的浓度为MBC 值。实验重复进行3 次。

1.2.5 数据处理

实验结果均以平均数±标准偏差表示，采用SPSS17.0 软件对获得的数据进行分析(P=0.05)。

2 结果与分析

2.1 野生蓝莓对四种致病菌的抑制效果

由表1 可以看出，野生蓝莓对四种致病菌的抑制作用不同，四种食源性致病菌对野生蓝莓提取物的敏感程度也不同。副溶血性弧菌对野生蓝莓提取物最敏感，当野生蓝莓提取物浓度为62.5 mg/mL时，副溶血性弧菌的量减少了3.54 logCFU/mL，当提取物浓度达到125 mg/mL 时，副溶血性弧菌可以完全被杀死。金黄色葡萄球菌对野生蓝莓提取物最不敏感，当野生蓝莓提取物浓度为250 mg/mL 时，金黄色葡萄球菌的量仅减少了2.98 logCFU/mL，当提取物浓度高达500 mg/mL 时，金黄色葡萄球菌可以被完全杀死。

表1 野生蓝莓提取物对四种致病菌的抑制效果Table 1 The antibacterial effects of wild blueberry extracts against the 4 investigated bacteria

注:a 表示经24 h 培养后，生长对照组菌落总数与实验组菌落总数有显著性差异(P＜0.05)。Note:a represents a significance difference from control after 24 h’s cultivation (P＜0.05).

2.2 野生蓝莓对四种食源性致病菌MIC 值的测定

利用试管二倍稀释法，通过观察每支试管浑浊度的变化以及辅助涂布平板的方法，分别测定了野生蓝莓提取物对四种致病菌的MIC 值。

表2 野生蓝莓对四种致病菌的MIC 测定结果Table 2 The MIC of wild blueberry extracts against the 4 investigated bacteria

由表2 可以看出，野生蓝莓对四种致病菌铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌以及副溶血性弧菌都有抑制作用，而且对不同菌的抑制程度不同。野生蓝莓提取物对副溶血性弧菌的抑制作用最强，MIC 为31.25 mg/mL，对铜绿假单胞菌的MIC为62.5 mg/mL，对单增李斯特菌的MIC 为250 mg/mL，而野生蓝莓提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果较差，MIC 高达500 mg/mL。

2.3 野生蓝莓对四种食源性致病菌MBC 值的测定

在MIC 的基础上，选取所有澄清的试管，进行涂布平板，培养24 h，以菌落数不超过5 个的最低药物浓度为该药物的MBC 值。

表3 野生蓝莓对四种致病菌的MBC 值Table 3 The MBC of wild blueberry extracts against 4 investigated bacteria

由表3 可以看出，野生蓝莓对单增李斯特菌和铜绿假单胞菌的MBC 值均为250 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MBC 值为500 mg/mL，而对副溶血性弧菌的抑制效果最好，仅为125 mg/mL。

3 讨论

本研究结果表明，野生蓝莓提取物对四种致病菌均有不同程度的抑制作用。对铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌与副溶血性弧菌的MIC 值分别为62.5、250、500 mg/mL 与31.25 mg/mL。沈潇［7］等人的研究表明，栽培蓝莓杜克和蓝丰对金黄色葡萄球菌的MIC 分别为900 mg/mL 和600 mg/mL，远大于野生蓝莓对金黄色葡萄球菌的MIC值500 mg/mL。由此可得，野生蓝莓能更好的抑制金黄色葡萄球菌的生长。Wu［8］等通过研究美国越橘中酚醛、花青素和有机酸等成分对大肠杆菌O157:H7 的抑制作用，得出这3 种成分均有不同程度的抑菌效果，且酚类物质的抑菌效果最好。而Buratti［9］等人曾研究过野生蓝莓和栽培蓝莓中的酚类物质含量的差异，结果表明:野生蓝莓中的总酚含量是栽培蓝莓中总酚含量的两倍。本课题组研究表明野生蓝莓对金黄色葡萄球菌抑制效果比栽培蓝莓好，可能是因为野生蓝莓比栽培蓝莓含有更多的酚类物质，因此表现出比栽培蓝莓更强的抑菌活性。

通过抑菌实验测定，发现野生蓝莓提取物对副溶血性弧菌的MIC 值和MBC 值最小，抑菌效果最好，而对金黄色葡萄球菌的MIC 值和MBC 值最大，说明抑制效果最差。Wu［10］等人研究表明，美国蓝莓提取物中的抑菌活性物质通过破坏细菌细胞的细胞壁，细胞膜从而导致细菌溶解而死亡。根据本研究所得结果，副溶血性弧菌(革兰氏阴性)对野生蓝莓提取物远比金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)敏感。这可能是由于革兰氏阳性细菌的细胞壁较革兰氏阴性细菌的细胞壁厚，抑菌成分不容易破坏其细胞壁，所以对革兰氏阳性细菌的抑制效果不如革兰氏阴性细菌好。

蓝莓具有降低血压、保护视力、延缓衰老和增强记忆力等功能。本研究表明野生蓝莓对致病菌还具一定的抑制作用。因此，正常人每天食用一定的蓝莓鲜果，不仅可以起到保健功能，而且还可以大大降低每天由食物中摄入的致病菌的含量。近年来，国内对于人工栽培蓝莓的研究已经成为一大热点，包括它的活性成分和营养价值，然而关于野生蓝莓的研究报道却比较少。由于野生蓝莓产业化程度低、掠夺式采摘现象较为严重，造成野生资源的严重浪费，经研究发现，野生蓝莓对致病菌有较强的抑制作用，而天然植物防腐剂又是当今研究的一大热点，所以开发利用野生蓝莓作为天然、无毒无害的防腐剂具有广阔的市场前景，可以创造经济效益。

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