HPLC 法测定神安颗粒中五味子醇甲含量的研究

易延逵，蔡光先，杨永华

1南方医科大学，广州 510515;2 湖南中医药大学，长沙 410006

神安颗粒是湖南中医药大学蔡光先教授的经验方，由天麻、酸枣仁、丹参、首乌藤、百合花、五味子等6 味药组成，功能益气养血、疏郁定惊、清心除烦、补脑安眠。用于各种慢性疾病引起的头昏眼花、心神焦悴、失眠多梦、记忆力减退、疲倦无力等。安神原方应用方法为:天麻、酸枣仁、丹参、首乌藤、百合花、五味子等各味粉碎成粗粉，开水泡服。很明显，原方应用不方便，服用量大，服用困难，口感苦涩。鉴于神安颗粒药方疗效确切、应用广泛及市面已有剂型的特点与现代人们用药的要求，我们选择神安处方为研究载体，对原工艺进行改进，采用超细粉体技术及现代提取工艺等现代制药工艺，研制神安颗粒制剂，在保持传统中医药特色的基础上，大量采用现代制药技术，提高药物的生物利用度。

在对中药质量控制的研究中，我们提出了应对中药进行多指标质量控制，即根据中药制剂的成分分析、制备工艺及其与功能主治、相关药效作用等，确定中药所含有的具体各类成分，进而根据每一类成分的提取方法和仪器条件制定出相应的含量测定指标。神安颗粒基本工艺为天麻粉碎成微粉;丹参、五味子、百合花加90%乙醇渗漉提取其极性较小脂溶性成分;丹参、五味子、百合花醇提后药渣与酸枣仁、夜交藤加水提取，最后加入适量辅料制成颗粒。用于各种原因引起的心胸烦躁，失眠多梦，头昏乏力，记忆力减退等症状。根据神安颗粒的组成、功能主治和工艺，综合考虑，主要含有三类成分，一是贵细药材天麻经过超微粉碎直接入药，故含有以天麻素为指标性成分的天麻苷类成分;二是五味子、丹参等采用高浓度醇提，含有以五味子醇甲、丹参酮ⅡA为指标性成分的脂溶性成分;三是各药材经过水提，含有多量的水溶性成分，以丹参素、斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 等为指标性成分。本文采用HPLC 建立以五味子醇甲为指标性成分的脂溶性成分的含量测定方法。

1 仪器与试药

Agilent 1100 高效液相色谱仪(HPLC);色谱柱:Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm，5.0 μm);处理软件:ChemStation 数据处理软件。UV-2401 可见紫外分光光度仪(日本岛津);电子天平(0.001g，德国Sartrius BP110S)。

五味子醇甲对照品(批号:110857-200709，由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用);神安颗粒(自制);甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

参照有关文献报道［4-10］，选择HPLC 法测定五味子醇甲含量，并进行了方法学考察。

2.1 色谱条件及系统适用性试验

流动相:甲醇-水(60∶40);检测波长为250 nm。理论板数按五味子醇甲峰计算不低于2000。

2.2 检测波长的选择

根据五味子醇甲的理化性质，在紫外区域有最大吸收，故取五味子醇甲对照品，采用甲醇配成约0.3 mg/mL 的溶液，在200～400 nm 波长范围内扫描，结果五味子醇甲在250 nm 波长处有最大吸收，与文献报道一致，可作为HPLC 法测定五味子醇甲含量的检测波长。

2.3 供试品溶液制备方法的比较

取神安颗粒0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，分别超声处理(功率:240W，频率:45Hz)10 min、30 min、1 h，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，作为供试品溶液。测定，计算，结果见表1。从表1 中可见，以超声提取30 min 为宜。

表1 不同提取时间对五味子醇甲含量的影响Table 1 Effect of different time to the content of Schisandrin

2.4 对照品溶液的制备

取五味子醇甲对照品15 mg，精密称定，置100 mL 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每mL 中含五味子醇甲0.15 mg)。

2.5 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定。在选定条件下，五味子醇甲峰与样品中其它组分色谱峰可达基线分离，按五味子醇甲峰计算，理论板数在2000 以上，对照品、供试品色谱图分别见附图1(A、B)。

图1 五味子醇甲对照品(A)、神安颗粒样品(B)及阴性对照(C)的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of schisandrin standard (A)，Shenan granules sample (B)and blank (C)

2.6 专属性考查

按处方配比称取除五味子以外的其他药材适量，按制备工艺制成缺五味子的阴性样品，同法制备缺五味子的阴性样品溶液。按“2.5”项所述测定法测定，即得阴形样品色谱图，结果见附图1(C)。

2.7 方法学考察

2.7.1 线性范围

精密吸取对照品溶液1、5、10、20、40 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量(μL)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，回归方程为:Y=1923.4X +2.1234，R2=1.000。结果表明五味子醇甲在0.15～6.0 μg 范围内线性关系良好。

2.7.2 精密度试验

精密吸取供试品溶液10 μL，分别进样6 次，依法测定，结果RSD 值为1.98%。表明本方法精密度较好。

2.7.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h进行测定，结果24h 内峰面积RSD 值为2.77%。表明供试品溶液在24 h 内峰面积值基本稳定。

2.7.4 重复性试验

取同一批样品6 份，同法制备供试品溶液，依法测定，结果RSD 值为2.86%。表明本方法重复性较好。

2.7.5 加样回收率试验

取已测定含量的样品适量，共6 份，精密称定，分别加入五味子醇甲对照品溶液1 mL(0.13 mg/mL)，即0.13 mg，按供试品溶液的制备方法处理，测定峰面积，计算加样回收率，结果见表2。

表2 回收率测定结果Table 2 Results of recovery determining

结果表明，本方法加样回收率较好。

2.7.6 对照品纯度检查

取浓度为50 μg/mL 的五味子醇甲对照品溶液30 μL，按质量标准中含量测定项下的方法进行试验，结果检出其纯度为99.5%。

2.8 样品含量测定

取样品三批，依法进行含量测定，结果见表3。

表3 三批样品含量测定结果Table 3 Quantification results of schisandrin in 3 batch’s sample

2.9 药材中五味子醇甲含量测定试验

取五味子药材三批，按《中国药典》2010年版一部天麻项下含量测定方法检验，结果其五味子醇甲含量分别为0.5779%、0.6008%、0.5516%，液相色谱图见图2。

用五味子醇甲含量为0.5779%的药材投料试制样品，结果含量为1.255 mg/g。经计算本品转移率为86.87%。《中国药典》规定天麻药材中五味子醇甲含量不得少于0.40%，如采用该含量的药材投料，按60.0%的转移率计算，本品中五味子醇甲含量为0.6 mg/g。根据上述结果，暂定本品含天麻以五味子醇甲计，不低于0.600 mg/g。

3 讨论与结论

建立科学有效的中药质量控制体系，进行中药质量的控制研究，一直是中医药研究领域最重要的领域之一。中药质量控制研究也随着现代分析技术、仪器设备制造技术的发展而不断的发展。我们在对中成药质量控制的研究中，提出了应该采用多指标控制中成药的质量，应该根据中药制剂的成分分析、制备工艺及其与功能主治、相关药效作用等来确定需要控制的指标类成分。

图2 五味子醇甲对照品(A)及五味子药材(B)的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of schisandrin standard (A)and Fructus Schisandrae sample (B)

神安颗粒采用了三种工艺，即超微粉碎工艺、醇提工艺、水提工艺，而其原料药材成分也基本可以分为三类，即以天麻素为指标成分的天麻苷类成分;以五味子醇甲、丹参酮ⅡA 为指标性成分的脂溶性成分;以丹参素、斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 等为指标性成分的水溶性成分。因而其质量控制也应建立三类成分的质量控制指标。

五味子是神安颗粒的主要药物，也为含脂溶性成分的主要药物，五味子醇甲为其指标成分，2010版中国药典［4］五味子中五味子醇甲采用的也是高效液相色谱(HPLC)法，为此我们对其进行了研究，采用HPLC 法建立其含量测定方法。2010 版中国药典五味子中五味子醇甲的高效液相色谱含量测定方法中，和有关文献采用的有关条件有一定差异，经过反复实验，本文优化了神安颗粒中五味子醇甲的含量测定方法，并选择了供试品溶液的处理方法，结果样品分离效果好，测得神安颗粒中五味子醇甲含量约为1.30 mg/g。

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