γ–氨基丁酸检测方法的比较

（浙江新和成股份有限公司，浙江 新昌，312500）

γ-氨基丁酸又名4-氨基丁酸 （4-aminobutyric acid）和γ-氨酪酸，简称 GABA，是一种天然活性成分，广泛分布于动植物体内。其分子式为C4H9NO2，相对分子量为103.2，结构式如图1。

图1 GABA结构式

GABA是一种抑制性神经传递物质，具有重要的生理活性，如：抗焦虑[1]，降血压[2]，治疗癫痫[3]，改善睡眠[4]，抗衰老[5]，调节激素分泌[6]及神经营养[7]等。GABA已成为一种新型功能性因子，正广泛应用于食品、医药和化工等领域。GABA可以用化学合成法生产，也可以以植物富集法、微生物发酵法生产。

从产品质量检测角度考虑，GABA测定方法的可靠性和准确性至关重要。关于GABA的测定方法有很多种，如纸电泳法、纸层析法、比色法、高效液相色谱法和氨基酸分析仪测定法等，它们具有各自的优缺点。本实验以产GABA微生物发酵液为样本对GABA的测定方法进行了比较研究，确定了纸层析定性测定与高效液相色谱法定量测定GABA相结合的方法，优化了HPLC的条件和参数。此法方便可行，准确率较高。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

分析纯试剂：无水乙酸钠、正丁醇、冰醋酸、硼酸、三乙胺、OPA（邻苯二甲醛）、β–巯基乙醇、茚三酮、谷氨酸钠、磺基水杨酸。

γ–氨基丁酸（纯度99%）购于杭州迈瑞化工仪器有限公司。

色谱纯试剂：甲醇、乙腈。

1.2 主要溶液

1.2.1 纸层析用溶液

(1)不同展开剂

V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=4:1:3；4:1:1；4:2:1；2:1:1；5:3:2；3:2:1

(2)茚三酮溶液

1.5 g茚三酮+100 mL正丁醇+3.0 mL醋酸

(3)γ–氨基丁酸标准溶液

准确称量100 mg标准γ–氨基丁酸，用超纯水溶解后定容于100 mL容量瓶，得1 g/L的γ–氨基丁酸标准液，倒入试剂瓶，4℃冷藏备用。其它浓度的γ–氨基丁酸标样在使用时由该标准液稀释而成。

1.2.2 高效液相色谱法用溶液

(1)衍生化试剂配制：将OPA 10 mg，β–巯基乙醇10 μL溶于2.5 mL乙腈。

(2)0.4 mol/L 硼酸缓冲液（pH=10.4）：取硼酸2.47 g，溶于100 mL超纯水，调pH=10.4。

(3)0.02 mol/L 醋酸钠缓冲液（pH=7.2）：取乙酸钠1.64 g溶于1000 mL超纯水，加入三乙胺180 μL，调 pH=7.2。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵液γ-氨基丁酸的定性测定

发酵液离心除菌样品经纸层析分离、显色后，不同氨基酸色斑的Rf值不同，因此可根据Rf值大小定性判断。具体方法如下：

(1)点样：将滤纸裁成适当大小，宽度大约为15～20 cm，长度依据样品的个数来决定，用铅笔在距底边2 cm的地方划一道直线（称为原线），线上每隔1 cm标上一个点，写上点样标记，然后用移液枪吸取2 μL发酵液的上清液，轻轻点在纸上标记的位置；取1 g/L的γ–氨基丁酸标样和谷氨酸钠标样点样，作标准样对照。点样时应保持滤纸洁净。

(2)展开：在层析缸上端悬挂一条线，将展开剂倒入层析缸中，溶液高度约为1 cm，然后将滤纸点有样品的一端缓缓放入缸内的展开剂中并把滤纸悬挂于线上，滤纸应避免接触层析缸内壁，纸的底部应平行浸于展开剂中。

(3)显色：展开3 h后，取出滤纸并用吹风机将其吹干，再向滤纸上喷洒茚三酮溶液，吹干后，放于70℃电热鼓风箱中显色5 min。

1.3.2 高效液相色谱法测定γ-氨基丁酸

(1)样品预处理：用50 g/L的三氯乙酸稀释发酵液上清液至适当浓度，以0.45 μm的滤膜过滤待测。

(2)样品衍生：吸取400 μL硼酸缓冲液，80 μL样品溶液和OPA衍生试剂160 μL，混合后室温反应2 min。

(3)绘制标准曲线：将1 g/L GABA标样依次稀释至 0.8 g/L、0.6 g/L、0.4 g/L、0.2 g/L、0.1 g/L，衍生后分别吸取20 μL进样。HPLC条件为：流动相V(pH=7.5，0.02 mol/L 醋酸钠缓冲液)：V（乙腈）=3:1， 色谱柱为 SunFireTMC18柱 （4.6mm×250mm,5 μm），检测器为紫外检测器，检测波长为338 nm，流速为0.8 mL/min，洗脱时间10 min，进样量20 μL。以GABA的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 氨基酸分析仪测定γ-氨基丁酸

(1)样品处理：取发酵液1 mL于离心管中，加入9 mL 1%磺基水杨酸，混合后室温静置15 min，10000 rmp离心5 min；再取上清液用1%磺基水杨酸稀释一定倍数，使样品中氨基酸的浓度在100 nmol/mL范围内，取稀释的样品溶液过0.45 μm的滤膜后上机。

(2)绘制标准曲线：用1%磺基水杨酸配制GABA标准溶液20 mg/L，再将此浓度的标样用1%磺基水杨酸稀释至 15 mg/L，10 mg/L，5 mg/L，1 mg/L，取标样溶液过0.45 μm的滤膜后上机。色谱条件为：色谱柱（PEEK 4.6 mm×150 mm），柱温130℃，检测波长 570 nm，进样量 50 μL，流速 0.7 mL/min，洗脱时间13 min。以GABA的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 纸层析法

为达到更好的分离效果，比较了几种不同配比的展开剂，其结果见表1。

表1 不同配比的展开剂对γ–氨基丁酸的层析效果

由表1可以看出，展开剂为V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=4:1:3时，GABA和谷氨酸钠的Rf值有明显差异，且斑点清晰没有脱尾，不易扩散，因此其对GABA和谷氨酸钠的分离效果最好。其它展开剂均没有此效果好，所以我们选用V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=4:1:3作展开剂。其层析效果见图2。

图2 发酵液中GABA的纸层析结果

图3 GABA标样的高效液相色谱图

2.2 高效液相色谱法

2.2.1 GABA标准曲线的绘制

在上述高效液相色谱条件下，GABA的保留时间为5.571 min，其色谱图见图3。以GABA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制的标准曲线见图4。从图4可以看出，在0～1 g/L范围内，峰面积和GABA的浓度之间的线性关系良好(R2=0.9994)，能用于GABA的定量分析。

图4 GABA标准曲线

2.2.2 发酵液的液相色谱图

在上述色谱条件下，经处理后的样品液得到很好的洗脱和分离，在5.548 min时检测到GABA，这和标准品出峰时间相同，其色谱图见图5。

2.2.3 精密度和回收率的测试

图5 发酵液的高效液相色谱图

为测定该方法的精密度，对0.5 g/L的GABA标准液进行5次平行测定，测定结果、标准偏差和RSD见表2。为确定该方法的准确度，进行了回收率试验。将含有GABA的发酵液加入不同浓度的标准品，再进行衍生化处理进样测定，其回收率见表3。

表2 高效液相色谱法测定GABA精密度

表3 高效液相色谱法测定GABA的回收率

由表3可知，该方法的相对标准偏差(RSD)为1.68%，精密度较高，重现性较好。从表3可得GABA平均回收率为97.4%，说明此测定方法的准确度较好，可用于GABA定量测定。

2.3 氨基酸分析仪法

2.3.1 GABA标准曲线的绘制

图6 GABA标品氨基酸色谱图

图7 GABA标准曲线

在上述氨基酸分析仪的操作条件下，检测到GABA的出峰时间为10.89 min，其色谱图见图6。以GABA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制的标准曲线见图7。从图7得出，在1～20 mg/L范围内，峰面积和GABA的浓度之间的线性关系良好(R2=0.999)，适合GABA的定量分析。

2.3.2 发酵液的氨基酸色谱图

处理后的发酵液送氨基酸分析仪检测，得到很好的洗脱和分离，且峰形稳定，发酵液中GABA出峰时间与标准品相同，其色谱图见图8。

3 结论

(1)纸层析法检测GABA具有简单、快速、有效等优点，在展开剂 V(正丁醇)：V(冰醋酸)：V(水)=4:1:3条件下，得到的图谱清晰、斑点明显、无脱尾，可用于检测发酵液中有GABA。另有文献报道[8]，可将茚三酮直接加入展开剂中，展开后直接放于电烘箱中显色，节省时间，此方法可做参考。

图8 发酵液的氨基酸色谱图

(2)高效液相色谱法和氨基酸分析仪法都能定量分析发酵液中GABA浓度。高效液相色谱法以邻苯二甲醛作为衍生剂，用反相C18柱为分离柱，在338 nm下进行检测，结果表明，此方法精密度较高，准确度较好，但是操作过程较繁琐。氨基酸分析仪法采用茚三酮柱后衍生，稳定性好、灵敏度高、操作简便，但要求样品氨基酸浓度在100 nmol/mL范围内，使用费用高。出于经济和实验条件考虑，选择高效液相色谱法定量检测GABA。

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