南极假丝酵母脂肪酶B的克隆、表达及发酵条件优化

（浙江工业大学 生物工程研究所，浙江 杭州 310014）

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)可催化水解、酯化、转酯化及聚合等反应，被广泛应用于医药、食品、化工、日化、纺织等领域[1-3]。CALB在水相、有机相中具有催化活性高，稳定性、立体选择性好及催化底物谱广等多种优势，无论是在酶学理论研究还是在实际工业生产领域，都受到广泛的关注[4-5]。自1995年以来，CALB已实现了在不同宿主中的克隆表达，如：大肠杆菌(Escherichia coli)[6]、米曲霉(Aspergillus oryzae)[7]、毕赤酵母(P.pastoris)[8]和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[9]等。CALB的克隆、表达为其在生产实践中的应用奠定了良好的基础。对于CALB研究已广泛展开，对其结构测定[10-13]、固定化方法[14-16]及催化应用[17-19]等都已有了一定的研究，但对其毕赤酵母工程菌的发酵条件优化研究较少，探索最优发酵条件具有巨大的工业应用价值。

本课题组从实验室保藏的原始菌株C.antarctica ZJB09193出发，利用RT-PCR技术克隆CALB基因，并实现其在真核宿主菌P.pastoris中的高效表达。以该重组毕赤酵母为研究对象，以获得高产CALB为目标，进行15 L发酵罐的发酵条件优化，主要包括通气量、搅拌转速、初始pH、接种量及诱导剂量的优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体

南极假丝酵母 (C.antarctica ZJB09193)为本实验室保存，该菌株现保藏于武汉普通培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2010263；大肠杆菌(E.coli JM109)和毕赤酵母(P.pastoris X-33)均为本实验室保存；克隆载体pMD18-T vector购自TaKaRa公司，毕赤酵母表达质粒pPICZαA为Promega公司产品。

1.1.2 试剂

限制性内切酶 XhoI、XbaI、SacI、T4 DNA 连接酶购自 Fermentas公司；Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP购自上海申能博彩公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen公司。

1.1.3 引物

引物 1：序列为 5’-ATATTACCTAGTGGTTCCGACCCTGC-3’，引物 2：Oligo(dT)18，根据 mRNA 3’末端结构进行设计。引物 3：5’-AATCTCGAGTTACCTAGTGGTTCCGACC-3’；引物 4：5’-AGGTCTAGAAGGAGTAACAATTCCTGAAC-3’，以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.1.4 培养基

YPD培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。固体培养基添加2.0%琼脂。

BMMY培养基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，l M 磷酸钾缓冲液（pH 6.0）100 mL，酵母氮基3.4，硫酸铵10。上述培养基配好后，灭菌，冷却至室温，每升加 2 mL 500×生物素，10.4 mL 96×组氨酸。

BMGY培养基配方是在BMGY培养基的基础上添加1%甘油（v/v）。

基础盐培养基(g/L)：磷酸 186.9 mL，硫酸钙0.93，硫酸钾 18.2，硫酸镁 14.9，氢氧化钾 4.13，甘油 40，pH 5.5。

流加培养基(g/L）：硫酸铜6.0，碘化钠0.08，硫酸锰 3.0，钼酸钠 0.2，硼酸 0.02，氯化钴 0.5，氯化锌20.0，硫酸亚铁65，生物素0.2，硫酸5 mL/L。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pPICZαA-CALB的构建

从C.antarctica ZJB09193中提取总RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一条链。用cDNA第一条链混合物为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增。PCR程序：95℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，56℃退火1 min，72℃延伸 2 min，35 个循环；最后 72℃延伸10 min。PCR产物进行胶回收，利用Taq DNA聚合酶为目的基因两端加碱基A后与pMD18-T载体连接，构建克隆载体pMD18-T-CALB。将连接产物转化至E.coli JM109感受态细胞中，经过蓝白筛选挑取白色克隆提取质粒进行测序，根据测序结果设计引物3、引物4。

以pMD18-T-CALB为模板，利用引物3、引物4扩增CALB的结构基因，经限制性内切酶XbaI和XhoI消化后与酵母表达载体pPICZαA连接，构建表达载体pPICZα A-CALB。将表达载体导入宿主菌E.coli JM109中，涂布于含100 μg/μL Zeocin的LB琼脂平板，37℃培养过夜，随机挑取转化子培养后提取重组质粒，酶切鉴定构建的重组载体pPICZαA-CALB。重组质粒分别被XbaI和XhoI酶切后得到4500 bp大小的片段，被XbaI和XhoI双酶切获得两条分别为1000 bp和3500 bp大小的片段，它们分别与目的基因和重组载体大小一致，初步证明目的基因已成功插入载体pPICZαA中。提取经鉴定连接正确的表达载体pPICZαA-CALB，利用SacI进行线性化后电转化至毕赤酵母 X-33中，涂布于含 100μg/μL Zeocin的YPDS平板。28℃培养，三天后可见平板上有白色，圆状凸起的菌落。

1.2.2 重组脂肪酶的诱导表达及SDS-PAGE分析

（一）摇瓶发酵生产

挑取单菌落，接种于5 mL BMGY培养基中，于 28℃、200 rpm 培养 24 h。4℃，8000 rpm 离心10 min，收集菌体。用25 mL BMMY培养基重悬菌体，将菌悬液转移至500 mL的摇瓶中，28℃，200 rpm继续培养。向培养基中添加100%甲醇至终浓度约为1.0%，3次/天，诱导培养3天。4℃、8000 rpm离心15 min，回收上清。取 10 μL上清液，加入等体积的 2×上样缓冲液，混匀后沸水浴10 min用于SDS-PAGE分析。

（二）上罐发酵生产

（1）种子液的制备

挑取P.pastoris X-33/pPICZaA-CALB的单菌落接种至种子培养基BMGY中，28℃，200 rpm摇床培养24 h。在无菌条件下将种子液移入灭菌的离心杯中，4℃，8000 rpm离心10 min，弃上清，用基础盐培养基重悬菌体，按10%接种量接种于含5.5 L基础盐培养基的15 L发酵罐中，600 rpm，28℃培养。

（2）流加培养液的补料

接种后，菌种会消耗基础盐培养基中的甘油，经过一段适应期后进入指数生长期。在这一过程中，罐体的溶氧下降，当甘油消耗完毕溶氧上升，此时流加50%甘油，流速约为1.65 mL/min，时间为6h，同时溶氧改用纯氧和空气混合控制，空气和氧气分别有流量计，在后续发酵过程中，通过调节通气量、氧气的流量或转速使DO控制在30%-60%。在此期间pH通过流加25%氨水和30%磷酸控制在5左右。

（3）CALB的诱导表达—诱导培养基的流加

流加50%甘油结束后，待溶氧再一次上升时，流加2376 mL纯甲醇和99 mL流加培养基的混合液，流速约为0.55 mL/min。诱导培养72 h后，4℃、12000 rpm离心5 min，收集发酵上清。

1.2.3 生物量的测定

取1 mL发酵液，12000 rpm离心5 min收集菌体，90℃烘干至恒重，即为发酵液的生物量，以g/L计。

1.2.4 脂肪酶酶活的测定方法

以对硝基苯乙酸酯(p-nitrophenyl acetate,p-NPA)为底物，利用多功能酶标仪测定脂肪酶的活性。反应体系如下：900 μL 20 mM Tris-HCl缓冲液，50 μL 10 mM p-NPA 乙腈溶液，50μL 酶液，30℃反应2 min(此时处于反应初速度时间范围内)。测定反应液在405 nm处的吸光值变化。

酶活单位(U)：在 30℃，pH 8.0 条件下，1 min内催化生成1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量定义为1 U。

2 结果与讨论

2.1 重组脂肪酶的构建及表达

从C.antarctica ZJB09193总RNA中成功获得0.8 kp的DNA片段，从经过测序及DNAMEN软件分析序列验证，该片段是南极假丝酵母脂肪酶B基因。将其成功克隆、构建了表达载体pPICZαA-CALB，如图1所示。根据对重组毕赤酵母鉴定的结果，将含有CALB基因的转化子接种至BMGY培养基中培养24 h后，再转移至BMMY培养基中进行诱导表达，间隔一定的时间取样，利用SDS-PAGE检测发酵液中的蛋白表达情况，结果如图2。在加入甲醇诱导后，目标蛋白表达成功，在诱导前期，随着诱导时间延长，南极假丝酵母脂肪酶B的表达量也逐渐变多。

图1 表达载体pPICZαA-CALB的构建

图2 摇瓶发酵上清液的SDS-PAGE

2.2 重组脂肪酶的上罐条件优化

2.2.1 通气量对重组毕赤酵母产酶的影响

将发酵培养的初始pH调至5.5，分别以 8 L/min，10 L/min，12 L/min 的通气量进行发酵，通过搅拌速度，罐压，补料速度等控制DO在20%以上，发酵72 h。其结果如图3所示。由图可知，当通气量为8 L/min时，酶活最低；当通气量为10 L/min时，酶活最高为4.8 U/mL，继续增大通气量，基本不会提高酶活，但是过大的通气量在发酵后期会产生大量的泡沫，不易控制且增大污染的机会，所以选择通气量为10 L/min。

图3 通气量对南极假丝酵母产脂肪酶的影响

2.2.2 搅拌速率对重组毕赤酵母产酶的影响

将发酵培养的初始pH调至5.5，初始通气量为10 L/min，控制DO在20%以上，发酵72 h考察搅拌速率对产酶的影响。结果如图4。从图中可以可出以800 r/min为宜，过大或过小的搅拌速率酶活均有不同程度的下降，搅拌速率适当提高可以使酶活最高峰提前。

图4 搅拌速率对南极假丝酵母产脂肪酶的影响

2.2.3 接种量对重组毕赤酵母产酶的影响

将发酵培养的初始pH调至5.5，搅拌速度为800 r/min，通气量为10 L/min，选择不同的接种量，控制DO在20%以上，发酵72 h后，测定脂肪酶活力。结果如表1所示。从表中可以看出，以10%接种量为最佳。

表1 接种量对酶活力的影响

2.2.4 初始pH对重组毕赤酵母产酶的影响

控制初始搅拌速度是800 r/min，通气量为10 L/min，接种量为10%，控制不同初始pH，发酵72 h后，测定脂肪酶活力。结果如表2所示。从表中可以看出菌体的产酶是在一个偏酸性的条件下，5.5为最佳，过低的pH不利于菌体的生长并会抑制酶的活性。

表2 初始pH对酶活力的影响

2.2.5 发酵时间对重组毕赤酵母产酶的影响

通过上述的实验，确定发酵罐操作参数如下：初始pH 5.5，接种量为10%，通气量为10 L/min,搅拌速度是800 r/min，作发酵过程中生物量与酶活力随时间变化曲线，如图5所示。从图中可以看出在5.5 L的基础盐培养基进行发酵培养，在诱导剂为3500 mL左右，菌体及酶活菌达到最高，酶活最高值为5.4 U/mL。

图5 重组脂肪酶的生长及发酵产酶曲线

3 结论

从Candida antarctica ZJB09193菌株中成功克隆南极假丝酵母脂肪酶B基因，构建的表达载体pPICZαA-CALB线性化后导入表达宿主毕赤酵母X-33中，经甲醇（终浓度约为1.0%）诱导实现CALB功能性表达。本文还研究了在15 L发酵罐中，重组菌P.pastoris X-33/pPICZαA-CALB的发酵条件优化，最终确定通气量10 L/min，搅拌速度为800 r/min，初始pH 5.5，接种量10%，诱导剂量3500 mL可以达到较好的产酶量。确定DO为发酵控制的一个重要指标，DO大于20%可确保发酵和产酶正常进行。本研究为重组南极假丝酵母脂肪酶B的放大生产奠定了基础。

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