杉木叶绿体微卫星及其单倍型变异分析

文亚峰，韩文军，周 宏

(1. 中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2. 广东省韶关市林业局，广东 韶关 512000)

杉木Cunninghamia lanceolata是我国南方重要的用材林树种，具有生长快、产量高、材质好、用途广等特点。但杉木分子遗传学研究基础非常薄弱，严重滞后于杨树、桉树、松树等其他用材林树种。就分子标记开发而言，目前杉木研究所用的标记类型仍以RAPD[1]、ISSR[2]、AFLP[3]等显性标记为主，微卫星（SSR）标记开发数量极为有限[4-5]，阻碍了杉木分子遗传学研究的发展。共显性标记位点的开发将对杉木分子遗传学研究产生很大促进作用。

与核基因组DNA相比，叶绿体基因组呈单亲遗传，保守性强，具有分子量小、多拷贝和结构简单等特点[6]。基于短核苷酸重复序列而开发的叶绿体微卫星（cp-SSR）是一种新型标记技术，不仅具有SSR标记的优点，而且兼顾叶绿体基因组的特点，可用于植物群体遗传分析、系统发育和细胞质遗传分析等[7-9]。杉木叶绿体基因组呈母性遗传方式[10]，叶绿体微卫星标记还可为杉木优良种子来源、母本繁殖、种子基因流检测等提供强有力的技术手段。本文中以选自黑松和日本柳杉等的21个叶绿体微卫星为候选位点，通过种（属、科）间扩增为杉木筛选适合的标记位点。

1 材料与方法

1.1 样本材料

16个杉木优树单株（不同家系或无性系）用于检测候选SSR位点、评估其多态性，其中12株（Y6, Y18, J5, J80, Ht14, Ht16, Jh10, Jh16, Y26,J18, Y110, Y1116）来源于湖南省攸县杉木种子园（N27°18′, E113°47′），4 株（Lc6, Lc12, Lc18,Lc418）来源于广东省乐昌市龙山杉木种子园（N25°12′, E113°28′）。不同杉木单株采嫩叶若干，干燥硅胶保存待用，DNA提取按改良CTAB法进行[11]。

1.2 候选叶绿体SSR位点

21个候选叶绿体SSR位点中有8个（Pt1254、Pt63718、Pt102584、Pt9383、Pt15169、Pt110048、Pt36480、Pt107517） 选 自黑 松 Pinus thunbergii[12]、12个（CJCP1m_002、CJCP1m_003、CJCP1m_004、CJCP1m_007、CJCP2m_001、CJCP2m_002、CJCP2m_006、CJCP2m_007、CJCP2m_008、CJCP2m_009、CJCP2m_010、CJCP3）选自日本柳杉Cryptomeria japonica[13]、1个位点(cp56)的引物根据台湾杉Cunninghamia konishii叶绿体非编码区序列（Gi:30270556）自行设计。

1.3 PCR扩增与多态性分析

首先利用2个样本材料检测候选SSR位点能否成功扩增，PCR扩增体系和条件按QIAGEN®多重PCR 试剂盒方法并做适当调整。6.0 μL扩增体系中含1× PCR混合液、0.2 μmol正向和反向引物、5～10 ng的DNA模板。PCR反应条件为：95 ℃ 预变性 15 min；94 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火90 s，72℃延伸60 s，共35个循环；60℃延伸30 min，利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测候选位点是否有扩增条带。对于PCR成功扩增的SSR位点，正向引物5' 端以FAM荧光标记后用于PCR扩增，扩增方法与前面相同。16个样本的PCR片段基因分型在ABI3100自动测序仪上进行（Liz 600 为内标）。GeneScan收集基因分型结果，基因片段分析用Genotyper3.7软件。HaplotypeAnalysis1.05软件用于多态性位点单倍型分析，估算参数包括单倍型数量（A）、有效单倍型数量（Ne）、单倍型丰富度（Rh）和位点多样性指数（H）等。

1.4 多态性位点的单倍型测序与分析

多态性位点的PCR扩增结果直接用于测序分析。测序按BigDye®Terminator v3.1 试剂盒方法 (Applied Biosystems)进行，PCR产物经乙醇纯化后在ABI3100测序仪上双向测序（F和R端）。序列经Sequencher 4.10软件剪切、拼接后用MEGA 5.05软件比对分析。

2 结果与分析

2.1 叶绿体SSR扩增结果

21个候选位点中有10个能够成功扩增，产生了清晰条带，这10个位点的特征信息见表1。成功扩增位点有7个来自日本柳杉，属间扩增成功率达到了58.3%；有2个来自黑松，科间扩增成功率为25.0%。cp56位点来自台湾杉叶绿体非编码区序列，也得到了成功扩增。根据已有研究结果，不同物种间扩增成功率与其亲缘关系密切相关，亲缘越近，扩增成功率越高[14-15]。杉木与柳杉是杉科不同属物种，而与黑松属不同科物种，来自日本柳杉的SSR位点成功率明显高于黑松。

2.2 多态性位点特性

16个杉木样本基因分型结果表明，扩增成 功 的10个 位 点 中2个（CJCP1m_004和CJCP2m_002）具有多态性，均来自于日本柳杉。位点CJCP1m_004检测到2个单倍型， 核苷酸长度分别为164 bp和165 bp，SSR重复单元为1 bp（见图1），与来源物种日本柳杉相同。该位点有效单倍型数量（Ne）为1.28，多样性指数为0.233。位点CJCP2m_002检测到6个单倍型，核苷酸长度分别为353、354、355、356、357和359 bp（见图2），其中既有2 bp重复单元，又出现1 bp重复单元类型，与来源物种日本柳杉的2 bp重复单元[(AT)8]并不相同。该位点有效单倍型数量（Ne）为3.2，多样性指数为0.733。

2.3 多态性位点单倍型变异分析

单倍型测序结果表明，CjCP1m_004位点的SSR重复单元为（T）n，与来源物种日本柳杉相同。但CJCP2m_002位点不仅有(AT)n2核苷酸重复单元，而且还存在(T)n单核苷酸重复单元（见图3），与来源物种（日本柳杉）并不相同。CJCP2m_002位点的单倍型测序分析进一步验证了基因分型结果的准确性。正是由于该位点在杉木叶绿体基因组中存在复合SSR重复单元，其单倍型变异则更为丰富。

表1 杉木种间扩增法成功扩增的cp-SSR位点信息†Table 1 Characterization of successful amplification loci of cp-SSR of C. lanceolata

图1 位点CJCP1m_004 基因分型检测结果（2个单倍型，每个单倍型各2个样本）Fig. 1 Genotyping of locus CJCP1m_004 (showed 2 haplotypes and 2 samples of each haplotype)

3 结论与讨论

传统微卫星标记开发以基因文库构建法（包括SSR富集文库）为主[16-17]，实验过程复杂，费时费力，效率较低。微卫星标记还可以利用种间扩增法[18]进行筛选，该方法基于微卫星侧翼序列的保守性，具有经济、高效、快速等特点，是微卫星标记开发的便捷方式。相对于核基因组而言，叶绿体基因组进化速度慢，保守性更强，很多叶绿体微卫星标记不仅能在种间有效扩增，而且属间、甚至不同科物种间也可能具有通用性。裸子植物中，Vendramin 等[6,19]开发的松Pinus、冷杉Abies叶绿体SSR可在多个科属物种间扩增，已成为裸子植物叶绿体微卫星通用标记。本研究选用的黑松叶绿体SSR在杉木中扩增成功率为25.0%，未发现多态性位点，但来自日本柳杉的SSR位点扩增成功率达到了58.3%，其中2个位点具有多态性。建议利用种间扩增法筛选候选标记时，应充分考虑物种间的亲缘关系，尽量从亲缘关系较近的物种筛选标记位点。实验中还有8个位点未检测到多态性，这可能与检测样本数量过少（16个）或样本间亲缘关系较近有关，相信随着杉木样本数量的增多或选用亲缘关系较远的种质，这些位点中可能还会有多态性位点存在。

图2 位点CJCP2m_002基因分型检测结果（6个单倍型）Fig. 2 Genotyping of locus CJCP2m_002 (showed 6 haplotypes)

图3 位点CJCP2m_002 的6个单倍型序列比对结果（SSR部分）Fig. 3 Sequencing alignment results of 6 haplotypes from locus CJCP2m_002 (SSR sequence)

虽然叶绿体基因组保守性强，但不同物种间SSR核心序列变异现象仍较为普遍。这种变异不仅有SSR重复长度的不同，而且重复单元（motif）本身也会存在变异[20]，从而引起扩增片段的高度多态性。Vendramin 等[6]检测发现有3个叶绿体SSR位点（Pt15169、Pt48210、Pt87268）在黑松和欧洲白皮松Pinus leucodermis之间存在重复单元变异，表现为在间隔一定数量核苷酸序列后，相同重复单元又会出现。我们在杉木序列分析中发现CJCP2m_002位点更为特别，该位点不仅存在SSR长度差异，而且同时存在单核苷酸和2核苷酸重复单元类型，其在杉木叶绿体基因组中呈现高度多态性，16个检测样本中发现6个单倍型，多样性指数达到了0.733。而在日本柳杉叶绿体基因组中，CJCP2m_002位点是2核苷酸重复单元类型，仅检测到2个单倍型[13]，多样性指数为0.201，这种现象说明CJCP2m_002在杉木叶绿体基因组中属于高突变位点。因此，笔者在利用种间扩增法筛选目标物种的SSR位点时，应仔细检查目标物种的扩增片段大小，必要时可对目标物种的单倍型（等位基因）进行测序分析，以全面掌握SSR核心序列的变异情况。

杉木叶绿体微卫星分析中，笔者利用ABI3100测序仪检测扩增位点的多态性和单倍型大小，毛细管电泳技术高效、灵敏，能准确分辨1 bp差异的扩增片段。叶绿体微卫星标记中单核苷酸重复类型较为普遍，单倍型之间可能仅是几个碱基，甚至1个碱基的差异，传统聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨能力有限。因此，在条件允许的情况下，建议利用自动测序仪进行叶绿体微卫星基因分型研究，以获得更为准确可靠的分析结果。

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