油茶叶枯病拮抗放线菌GR54发酵条件的优化

赵 莹，周国英，高月庭，杨 菁，李石磊

（中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

油茶叶枯病拮抗放线菌GR54发酵条件的优化

赵 莹，周国英，高月庭，杨 菁，李石磊

（中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

放线菌GR54对油茶叶枯病具有良好的拮抗效果。为对其进行开发利用，对其发酵条件的优化进行研究，以达到对油茶主要病害的防治作用。研究不同发酵培养液、碳氮源等营养因子，以及培养时间、接种量、装液量、初始pH值等非营养因子对放线菌发酵液抑菌活性的影响。综合考虑菌体干重和对油茶叶枯病菌的抑菌率2个指标，生防放线菌的优化发酵培养液为葡萄糖15 g、大豆粉10 g、NaCl 5 g、酵母膏1 g、CaCO31 g、蒸馏水1 000 mL，pH值7.0，接种量10%，装液量100 mL，28℃、160 r/min振荡培养7 d。生防放线菌GR54的发酵培养液可有效抑制油茶叶枯病病原菌，抑制率可达93.05%。

油茶病害，拮抗放线菌，发酵条件，优化

油茶Camellia oleifera Abel属于山茶科，山茶属，是我国南方重要的木本油料树种，具有很高的经济价值[1]。但油茶病害目前已成为制约油茶产业化发展的瓶颈[2]。近年来油茶叶枯病[3]Pestalotiopsis microspora发生严重，已上升为油茶主要病害，其导致果实和叶片脱落，严重影响油茶产量及质量[4]。以往针对此病多是喷洒托布津等化学农药，效果不甚理想[5]，而且由于药物残留及污染环境等，化学防治已越来越受到限制。微生物农药是近年来农药发展的新方向，其以优质高效、低残留、对环境友好安全等特点正逐步取代原有的化学农药，其中农用抗生素作为生物农药的重要类群，以其低毒低残留的特点备受重视[6-10]。然而，目前有关油茶叶枯病的生物防治方法研究较少，为此，本研究通过发酵培养从湖南攸县油茶基地油茶林根际土壤中分离筛选的对叶枯病菌有良好拮抗效果的放线菌GR54，以达到对油茶叶枯病进行防治的目的，并为其进一步开发利用和工业化生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

拮抗菌株——放线菌GR54，分离筛选自油茶根际土壤。

指示菌株——油茶叶枯病菌（Pestalotiopsis microspora），由我校微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 培养基

平板培养基[11]：高氏一号培养基，用于活化放线菌GR54；PDA培养基：用于病原菌的活化及抑菌活性的测定。

种子培养基：高氏一号液体培养基，用于放线菌GR54的种子液培养。

发酵培养液[11]：A（淀粉合成培养液）；B（葡萄糖黄豆粉酵母膏培养液）；C（葡萄糖蛋白胨培养液）；D（葡萄糖酵母膏培养液）；LB培养液；BPY培养液。用于初始发酵液筛选。

1.2 方 法

1.2.1 初始发酵培养液筛选

将拮抗放线菌GR54活化，用直径6 mm的灭菌打孔器打成菌饼若干，在300 mL三角瓶中接入100 mL种子液，每瓶接种1个菌饼，28℃、160 r/min培养5 d，获得发酵种子液。在编号为A、B、C、D、LB、BPY的300 mL三角瓶中各接入50 mL发酵培养液，再将10 mL种子液分别接种到六种供试发酵培养液中，28℃、160 r/min条件下振荡培养5d后取出菌丝体，30℃下烘干并称量其菌体干重，每处理重复3次。同时取1 mL上述六种发酵液分别与已灭菌并冷却至40℃左右的PDA培养基混匀制成平板，在平板中央接入已预先活化好的直径6 mm的指示菌菌饼，以不加发酵液的PDA培养基为对照，在28℃下培养5 d，用十字交叉法[12]测量菌落直径并计算抑菌率，每处理重复3次。以菌量最多和抑菌率最好的发酵培养液进行后续试验。

菌丝生长抑制率=[（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/（对照菌落生长直径-菌饼直径）]×100%

1.2.2 液体发酵条件优化

(1)培养时间对菌株GR54生长与抑菌活性的影响 在300 mL三角瓶中接入1.2.1中筛选出的发酵培养液100 mL，再接入5 mL种子液，28℃、160 r/min条件下振荡培养10 d。每天取出样品一瓶，取菌丝体在30℃下烘干，称量菌体干重；同时取发酵液1 mL与已灭菌并冷却至40℃左右的PDA培养基混匀制成平板，在平板中央接入直径6 mm的指示菌菌饼，以不加发酵液的PDA培养基为对照，28℃下培养5 d，用十字交叉法测量菌落直径并计算抑菌率，每处理重复3次。综合考虑菌体干重和抑菌率以确定最佳培养时间。

(2)接种量对菌株GR54生长与抑菌活性的影响 在300 mL三角瓶中，将放线菌GR54种子液分别以体积分数2%、5%、7%、10%、13%、15%接种到1.2.1中筛选出的发酵培养液中，28℃、160 r/min条件下振荡培养5 d后，按1.2.2(1)中的方法确定最佳接种量。

(3)装液量对菌株GR54生长与抑菌活性的影响 在300 mL三角瓶中分别装入20 mL、40 mL、60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、150 mL筛 选出的发酵培养液，再以5%的体积分数接入种子液，按1.2.2(1)中的方法确定最佳装液量。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件将两组血压控制情况、高血压知识、技能掌握、年门诊输液或住院例次数情况进行统计学分析。计量资料以±s表示。两组间比较采用t检验;组间前后比较采用配对t检验;率的比较用χ2检验。

(4)起始pH值对菌株GR54生长与抑菌活性的影响 先在300 mL三角瓶中装入100 mL筛选出的发酵培养液，再分别用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH将发酵培养液的pH值调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，再接入5 mL种子液，28℃、160 r/min下振荡培养5 d，按1.2.2(1)中的方法确定最适起始pH值。

(5)不同碳源对菌株GR54生长与抑菌活性的影响 以1.2.1中筛选出的B发酵培养液为基础，去掉其中的葡萄糖，再以2%的水平加入可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖，保持其他组分不变，配制成含有不同碳源的发酵培养液。再在其中加入5 mL种子液，28℃、160 r/min下振荡培养5 d，按1.2.2(1)中的方法确定最佳碳源。

(6)不同氮源对菌株GR54生长与抑菌活性的影响 以1.2.1中筛选出的B发酵培养液为基础，去掉其中的大豆粉，再以2%的水平加入酵母膏、蛋白胨、大豆粉、(NH4)2SO4、NH4NO3，保持其他组分不变，配制成含有不同氮源的发酵培养液。再在其中加入5 mL种子液，28℃、160 r/min下振荡培养5 d，按1.2.2(1)中的方法确定最佳氮源。

(7)碳氮源的优化对菌株GR54生长与抑菌活性的影响 选择不同的碳、氮源浓度进行3因素3水平的正交实验。利用正交表L933（3因素 3水平）安排实验，28℃、160 r/min下振荡培养5 d，按1.2.2(1)中的方法确定最佳碳、氮源优化组合。

表1 主要培养参数L933正交设计Table 1 Orthogonal design of main cultivate parameters

2 结果与分析

2.1 初始发酵培养液的筛选

初始发酵培养液的筛选结果见图1。由图可知，在6种供试培养液中，菌株GR54在B发酵培养液中菌体干重最大，达1.334 2 g，其次为C发酵培养液(1.276 1 g)；从抑菌率看，菌株CF17在B发酵培养液中抑菌率最大，可达93.05%，其次为C发酵培养液（91.56%），因此选用B发酵培养液进行后续试验。

图1 不同培养基对菌体生长及抑菌活性的影响Fig.1 Effects of different media on cell growth and antimicrobial activity

2.2 液体发酵条件的优化

2.2.1 培养时间对菌株GR54生长与抑菌活性的影响

2.2.2 接种量对菌株GR54生长与抑菌活性的影响

不同接种量对菌株GR54生长的影响见图3。由图可知，菌株生长随接种量比例的增加呈现先升高后缓慢降低的趋势，菌体干重在接种量为10%时达到最高值（1.593 6 g），抑菌率也在接种量为10%时达到最大值（94.23%），故最佳接种量选为10%。

图2 培养时间对菌体生长及抑菌活性的影响Fig.2 Effects of different culture time on cell growth and antimicrobial acrivity

图3 不同接种量对菌体生长及抑菌活性的影响Fig.3 Effect of different inoculum size to cell growth and antimicrobial activity

2.2.3 装液量对菌株GR54生长与抑菌活性的影响

不同装液量对菌株GR54生长的影响见图4。由图可知，菌株的生长随装液量的增加大致呈现先增加后降低的趋势，在装液量为100 mL时菌体干重达最大（1.105 4 g）；同时抑菌率在装液量为100 mL时达最大（90.12%），其他装液量情况下变化不大。故最佳装液量选为100 mL。

图4 不同装液量对菌体生长及抑菌活性的影响Fig.4 Effect of different liquid volume in fl ask on cell growth and antimicrobial activity

2.2.4 起始pH值对菌株GR54生长与抑菌活性的影响

不同起始pH值对菌株GR54生长的影响见图5。由图可知，菌株的生长随pH值的升高呈先上升后下降的趋势，在pH值为7时菌体干重达最大值（1.124 8 g）；pH值在4～7范围内抑菌率逐渐升高，在7～9范围内抑菌率逐渐降低，在pH值为7时抑菌率达最大值（89.63%），在低于4和高于9时，抑菌率较低。故最佳起始pH值为7。

图5 不同pH值对菌体生长及抑菌活性的影响Fig.5 Effects of different pH on cell growth and antimicrobial activity

2.2.5 不同碳源对菌株GR54生长与抑菌活性的影响

不同碳源对菌株GR54生长的影响见图6。由图可知，以葡萄糖作为碳源时，菌株GR54的菌体干重最大，为1.624 2 g，其次为蔗糖和可溶性淀粉。抑菌率方面，当葡萄糖为碳源时，抑菌率可达93.28%，其次为可溶性淀粉和蔗糖。故最佳碳源为葡萄糖。

图6 不同碳源对菌体生长及抑菌活性的影响Fig.6 Effects of different carbon sources on cell growth and antimicrobial activity

2.2.6 不同氮源对菌株GR54生长与抑菌活性的影响

不同氮源对菌株GR54生长的影响见图7。由图可知，以大豆粉为氮源时，菌体干重达最大值，为1.434 2 g，其次为酵母膏和蛋白胨。抑菌率方面，以大豆粉为氮源时，其抑菌率可达94.05%，其次为蛋白胨和NH4NO3，故最佳氮源为大豆粉。

图7 不同氮源对菌体生长及抑菌活性的影响Fig.7 Effects of different nitrogen sources on cell growth and antimicrobial activity

2.2.7 碳氮源的优化对菌株GR54生长与抑菌活性的影响

碳源选用葡萄糖，氮源选用大豆粉和酵母膏，进行3因素3水平的正交实验，实验结果见表2。

表2 碳氮源正交实验Table 2 Results of orthogonal experiment of carbon and nitrogen sources

根据这18组碳氮源正交实验结果表明，在不同的碳氮源配比条件下，菌株GR54的生长和抑菌活性均能达到较高的水平，抑菌率均可达80%以上。综合考虑最终选择以1.5%葡萄糖和1.0%大豆粉作为最佳碳氮比，在此条件下，菌体干重为1.589 g，抑菌率为96.8%。

3 结论与讨论

菌株发酵是一个非常复杂的过程，其中会受到很多因素的影响。本研究以菌体干重和抑菌率为主要衡量指标，对放线菌GR54的发酵条件进行了研究，最终确定最优发酵培养液为葡萄糖15 g、大豆粉10 g、NaCl 5 g、酵母膏1 g、CaCO31 g、蒸馏水1 000 mL。其中大豆粉营养均衡，蛋白质水解缓慢，前期可控制菌株的生长速度，不致过快而导致后劲不足，菌体过早衰老，且大豆粉含有丰富的有机氮，利于菌株吸收，并且廉价易得。而葡萄糖是最易吸收利用的碳源，适量添加有利于菌株生长，但过量添加会加速菌体呼吸而导致发酵液中溶解氧不足，因此通过正交实验最终确定葡萄糖添加量为1.5%。本研究发现当发酵液中存在天然碳、氮源时，会大大增加菌株的生长量，并能够在一定程度上反映抑菌活性，这与曹广丽等[13]、崔晋龙等[14]、许灵波等[15]的研究结果相一致。对菌株培养时间的研究发现，放线菌GR54在培养第5天时菌体干重达到最大值，而在培养第7天时抑菌率达到最大值，间隔为2 d，即菌株先生长再产生抑菌物质，这是因为大部分抗菌物质是菌株在生长过程中分泌的次级代谢产物，这与前人的实验结果相一致[14-16]。最佳发酵条件需保持一定的接种量与装液量，过低的接种量会导致培养液利用不完全，造成浪费，也会使菌株产量过低，无法达到较好的抑菌效果；反之则会导致菌株迅速生长，培养液大量消耗，造成后期生长缓慢，抑菌物质产量低。装液量过低会导致菌株可利用营养物质过少，抑菌活性物质产量低；过高则会导致发酵液中氧含量低，不利于菌株生长。同时在发酵液中加入了可有效调节发酵液pH值的

CaCO3，以及可在菌株合成代谢过程中充当调节物的无机盐NaCl，此外，若适量添加微量元素，抗生素的产量有望更高[17-20]。本研究为利用放线菌

GR54防治油茶叶枯病奠定了基础，并为进一步进行发酵罐培养提供了理论依据，但其实际防效以及对病原菌的持续控制作用仍需通过进一步的盆栽试验及田间防效实验加以完善。

[1] 何 方,何 柏.油茶栽培分布与立地分类的研究[J].林业科学,2002, 38(5): 64-73.

[2] 刘焕安.油茶常见病虫害及防治[J].安徽科技,2003,(4):37.

[3] 李 河,周国英,刘君昂.油茶叶枯病菌的生物学特性[J].经济林研究,2009,27(1):88-90.

[4] 国家林业局.全国林业生态建设与治理模式[M].北京:中国林业出版社,2003.

[5] 李 峰.油茶叶枯病治疗新方法[J].云南农业科技,1993,(1):11-15.

[6] 袁兵兵,张海青,陈 静. 微生物农药研究进展[J].山东轻工业学院学报,2010,24(1):45-49.

[7] Soe,De Costa. Development of a spore-based formulation of microbial pesticides for control of rice sheath blight [J].Biocontrol Science&Technology,2012,22(6):633-657.

[8] Smith-Howard. Antibiotics and Agricultural Change: Purifying Milk and Protecting Health in the Postwar Era[J].Agricultural History,2010,84(3):327-351.

[9] Liu Ping, Soupir Michelle L, Zwonitzer Martha. Association of Antibiotic Resistance in Agricultural Escherichia coli Isolates with Attachment to Quartz [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(19): 6945-6953.

[10] Smith David, Dushoff Jonathan, Morris Jr, et al. Agricultural Antibiotics and Human Health[J].Plos Medicine, 2005,2(8):731-735.

[11] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[12] 吴文君.植物化学保护实验技术导论[M].西安:陕西科学技术出版社,1988:43-173.

[13] 曹广丽,陈立梅,徐文静,等.番茄叶霉病菌拮抗链霉菌BPS2发酵条件的研究[J].中国农学通报,2006,22(5):341-345.

[14] 崔晋龙,刘 磊,王玉君,等.发酵条件对内生真菌SBO23抑菌活性的影响[J].首都师范大学学报,2008,29(4):42-45.

[15] 许灵波,申屠旭萍,陈宵峰,等.银杏内生真菌No.1028的培养条件及其代谢产物对作物真菌病害的抑制作用[J].菌物研究, 2006,4(2):25229.

[16] 何 红,沈兆昌,邱思鑫,等.内生拮抗枯草芽孢杆菌BS22菌株的发酵条件[J].中国生物防治,2004,20(1):38241.

[17] 梁肖青. SC2053诱导小麦雄性不育的效果研究[J].山西农业大学学报,2006,5(5) :92294.

[18] 周国英,宋光桃,李 河.油茶病虫害防治现状及应对措施[J].中南林业科技大学学报,2007,27(6):179-182.

[19] 游 嘉,周国英,刘君昂,等.油茶内生拮抗细菌Y13菌剂研制[J].中南林业科技大学学报,2010,30(4):131-134.

[20] 卢丽俐,周国英,李 河,等.油茶炭疽病拮抗真菌的分离与筛选[J].经济林研究,2009,27(1):54-56.

Optimization of fermentation conditions of actinomycete GR54 against Camellia oleifera leaf blight

ZHAO Ying, ZHOU Guo-ying, GAO Yue-ting, YANG Jing, LI Shi-lei
(Key Laboratory for Non-timber Product Forest Silviculture and Protection of Ministry of Education, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Actinomycete GR54 has a good ability against Camellia oleifera leaf blight. A lots of researches on the optimization of culture fermentation conditions of actinomycete GR54 against Camellia oleifera leaf blight were conducted in order to control the disease. The effects of trophic factors (different fermentation culture solution, carbon and nitrogen sources) and non-trophic factors (incubation time,inoculum size, loaded liquid and initial pH value) on the antibacterial activity of the fermentation broth were investigated. By take two factors(mycelium dry weight and rate of inhibiting bacteria ) into consideration, the best cultural solution formula consisted of glucose 15 g, soybean meal 10 g, NaCl 5 g, yeast extract 1g, CaCO31g, distilled water 1 000 mL, pH7.0, inoculum size 10%, loaded liquid 100 mL, 28℃, 160 r/min shaking cultivation for 7 days. The fermentation broth of the GR54 can effectively inhibit the pathogenic bacteria of Camilla oleifera leaf blight with an inhibitory rate of 93.05%.

Camellia oleifera disease; antagonism actinomycetes; fermentation conditions; optimization

S794.4；S763.1

A

1673-923X(2013)07-0081-05

2012-10-16

国家“十二五”科技计划课题（2012BAD19B0803）

赵 莹（1986-），女，辽宁丹东人，硕士研究生，主要从事微生物学研究

周国英（1966-），女，湖北应城人，博士 , 教授，博士生导师，主要从事森林保护、微生物学教学及研究

[本文编校：吴 毅]