红肉火龙果果皮色素的分离、纯化和HPLC-MS分析

袁亚芳，赵珍珍，王 威，陈清西，余志雄

(1.福建农业职业技术学院，福建 福州350119;2.福建农林大学园艺学院，福建 福州350002)

火龙果(Hylocereus undatus)为仙人掌科(Cactaceae)植物，又名仙蜜果、红龙果等.火龙果果肉富含糖、有机酸、蛋白质、氨基酸、维生素、矿质元素及膳食纤维［1］，还含有丰富的天然红色素.目前对火龙果的研究主要集中在营养成分的分析，有关火龙果色素的研究较少.张伟峰等［2］提出火龙果色素为花色苷与原花色苷素.而刘小玲等［3］研究表明，火龙果果皮、果肉色素都为甜菜苷类色素，并从果肉中分离出4种组分，从果皮中分离出2种组分.烟利亚［4］对红龙果果肉红色素进行分离，鉴定出10种化合物，主要为甜菜红苷.本文拟通过红外吸收光谱技术，结合液相色谱－质谱联用技术，分析火龙果果皮红色素的化学成分，为火龙果综合开发利用提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验所用火龙果由国信星火(漳州)红龙果开发有限公司提供，供试品种为‘红仙蜜’(Hylocereus undatus‘Hong Xian Mi’，红肉火龙果)，九成熟.选择无畸形、无病虫害的果实，以蒸馏水冲洗干净，去果肉取皮，用真空干燥.干燥后的果皮用多功能粉碎机研磨成粉末，过40目筛，于－40℃冰箱保存备用.

1.2 试剂

主要有盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、乙醚、乙酸乙酯和甲醇(色谱纯).

1.3 试验流程

1.4 方法

1.4.1 火龙果色素的初步纯化 以火龙果果皮冻干粉为原料，提取条件为浸提温度30℃，浸提时间45 min，提取剂pH值为6.5，乙醇体积分数40%.

取一定的色素提取液，加入2倍体积的乙醚溶液充分振荡、静置，等混合液完全分层后，收集下层的溶液，再用乙醚溶液萃取2次，得到除去脂质、脂溶性色素、黄酮、简单酚类的下层溶液，备用.将ODSC-18固相吸附柱先经甲醇激活，然后用0.01%(体积分数)的HCl溶液平衡.加入一定量的经乙醚萃取过的色素提取液，使色素吸附在柱上;然后用5倍体积的0.01%的HCl溶液将糖、酸等水溶性物质洗下;再用乙酸乙酯洗脱出低含量的多酚和低相对聚合度的单宁;再经0.01%盐酸—甲酸洗脱，将洗脱液在35℃下真空浓缩，去除甲醇，浓缩液以0.01%的HCl溶液稀释定容，得到火龙果果皮色素纯化液.

1.4.2 红外光谱分析 采用溴化钾压片法制备红外光谱分析材料.取纯化的火龙果果皮色素粉末1－2 mg，置于预热过的玛瑙研钵中，预热一段时间后，称取约200 mg纯溴化钾粉末与之混合，在红外灯下研磨成均匀细末，粒度小于2 μm;取出若干置于模具中，以约30 MPa压力在油压机上压成透明薄片，上样;在1000－4000 cm－1下对火龙果果皮材料进行红外光谱检测，研究色素的结构组成，光谱分辨率为4 cm－1.

1.4.3 HPLC分析 参考文献［4－6］，确定高效液相试验中的流动相为甲醇、乙腈、1.0%三氟乙酸和水溶液，流速为 1 mL·min－1，柱温为25 ℃，进样量20 μL.

1.4.4 HPLC-MS分析 以火龙果果皮色素纯化液为材料，采用液相色谱—质谱联用技术(HPLC/MS)对其进行定性分析，并测定红肉火龙果果皮色素各组成成分的含量.

2 结果与分析

2.1 红外光谱分析结果

(1)从图1可看出，火龙果果皮色素提取物在3404 cm－1处有特征吸收峰.3400－3600 cm－1是O－H键伸缩振动出现的吸收峰，说明该火龙果果皮色素中均含有O－H结构［7］.

图1 火龙果果皮色素提取物的红外吸收光谱图Fig.1 Infrared spectrum of natural red pigments from pitaya peel

(2)红外光谱中，3200－3600 cm－1为N－H和O－H的伸缩振动吸收峰，950－1200 cm－1的吸收峰是2种C－O振动伸缩引起的，即 C－O－C和 C－O－H［8］.2800－3000 cm－1为 C－H 键吸收峰，CH3－在(2872 ±10)cm－1－(2962 ±10)cm－1会出现相距约80 cm－1的双峰［7］.从图1可看出，该火龙果果皮色素在2930.40 cm－1处各有1个吸收峰，由此可推测火龙果果皮色素中有饱和C－H键存在.

(3)图1显示，该火龙果果皮色素提取物在1607.07 cm－1处有明显的吸收峰.据文献［9，10］，芳环或杂环吸收峰会在1420－1620 cm－1振动，芳环一般在1600、1580及1450 cm－1附近有尖锐的特征吸收峰，其强度随取代基团的不同而不同，由此可判断火龙果果皮色素中有芳环或杂环存在.

(4)图1显示，该火龙果果皮色素提取物在1000－1300 cm－1均有吸收峰.指纹区(650－1300 cm－1)分为2个区域，其中910－1300 cm－1区域是所有单键伸缩变形振动区，C－O键的伸缩振动在1000－1300 cm－1显示吸收［11，12］，可以判断火龙果果皮色素中有 C－O键存在.

综上分析表明，火龙果果皮色素物质内存在C－O－C键、C－O－H键、饱和C－H键、芳环或杂环、C－O键等.

2.2 HPLC、HPLC-MS 分析结果

根据文献［13］中最佳高效液相的流动相和保留时间，得到高效液相色谱图.对火龙果进行高效液相试验分析，在538 nm检测波长下得到的HPLC色谱图如图2所示.

图2 火龙果果皮色素高效液相色谱图Fig.2 HPLC spectra of the peel pigment of pitaya

由图2可知，火龙果果皮色素中各种成分均得到了较好的分离.各色谱峰的具体成分根据HPLCMS数据进行进一步分析.按照优化的液相色谱条件和质谱检测条件对红龙果红色素样品进行测定分析，得到正总离子流图(图3).

图3 火龙果果皮色素MS图Fig.3 The MS chromatograms of the peel pigment of pitaya

经液相分离及液质联用分析，从果皮中得到6种组分.根据文献报道，在检测波长为538 nm下，出现质荷比为551的离子峰，推测这个组分相对分子质量为550，且这一组分在11.8 min和14.8 min均有出现(图3a、图3b)，可推测这2种组分为同分异构体，为5-O-β-葡萄糖—甜菜苷结构式和5-O-β-葡萄糖—甜菜苷［5］;21.8 min与22.1 min均出现质荷比为637的离子峰(图3c、图3d)，可推测其甜菜苷色素类型为phyllocactin［3］;24.8 min时出现质荷比为507、695的离子峰(图3e)，最大吸收波长为538 nm，推测其分别为15-脱羧-5-O-β-葡萄糖－甜菜苷、戊酰-β-葡萄糖－甜菜苷(表1).

表1 火龙果果皮色素的质谱数据Table 1 Mass spetra data of the peel pigment of pitaya

3 小结与讨论

本研究结果表明火龙果果皮色素内存在C－O－C键、C－O－H键、饱和C－H键、芳环或杂环、C－O键.对各个液相色谱峰成分的鉴定结果表明，在果皮中鉴定出的6种化合物均为甜菜苷类色素.刘小玲等［3］对火龙果红色素基本结构的研究结果表明，从果皮中得到2个组分的甜菜苷结构.在本试验中，采用HPLC-MS技术对火龙果果皮色素的结构进行分析，在果皮中测到6种组分的甜菜苷结构.

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