玉郎伞多糖对Aβ25－35诱导PC12细胞凋亡的保护作用

陈晓宇，荣延平，张士军，黄仁彬 （广西医科大学药理学教研室，广西 南宁530021）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称早老性痴呆，是以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的原发性中枢神经系统退行性疾病，目前尚无特效治疗方法［1］。研究表明，AD 的发病率随着年龄的增长，呈指数上升，严重威胁着老年人的健康和生存质量，该病的防治已成为国内外医学界研究的热点［2］。

玉郎 伞Millettia Pulchra Kurz var.Laxior（Dunn）Z Wei.（YLS）是广西壮族习用药材，具有补气、补血、提高免疫力、抗衰老、抗应激、改善大脑记忆等功能。临床用于治疗老年健忘、小儿智力低下、体弱多病及病后、产后虚弱等症。其成分复杂，主要活性成分有多糖、黄酮、皂苷类等［3－5］。本研究从YLS提取多糖成分，并研究了玉郎伞多糖（YLSP）对Aβ25－35诱导PC12细胞凋亡的保护作用。

1 材料

1.1 仪器 CO2细胞培养箱（371型，Thermo scientific）；低速离心机（TDL－5－A 型，飞鸽）；倒置相差显微镜（CKX41 型，OLYMPUS）；透射电镜（H－7650型，HITACHI）；酶标仪（Multiskan MK3 型，Thermo labsystems）。

1.2 药品与试剂 YLSP（由广西医科大学药理学教研室提供，纯度93.1%，用HPLC 测定，批号20110302）；DMEM 高糖培养基（批号866169，购自Gibco公司）；DMEM 低糖培养基（批号NVJ0306，购自HyClone公司）；Aβ25－35（批号05OM4765，购自Sigma公司）；胎牛血清（FBS，批号A64905－0972，购自HyClone公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，批号M8180，购自Solarbio Amresco）；石杉碱甲（豫中制药厂，批号H10940156）；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 神经元细胞株 PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆株）购于中科院上海细胞所。

2 方法

2.1 细胞培养 PC12细胞培养于DMEM 高糖培养基，内含10%胎牛血清，100 U·mL－1青霉素，100 U·mL－1链霉素，置于37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养，每48～72 h传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 细胞存活率检测及形态学改变 取培养瓶中处于对数生长期的PC12细胞，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基将细胞稀释，以2×105个／mL细胞密度接种于96孔培养板，每孔100μL，放入恒温培养箱，37 ℃含5% CO2条件下培养24 h，实验共分6组，每组4孔。空白对照组：每孔只加入200μL无血清DMEM 低糖培养基；模型组：每孔分别加入用无血清DMEM 低糖培养基配制的终浓度为10μmol·L－1的Aβ25－35溶液200μL。阳性对照药组：用无血清DMEM 低糖培养基配制的石杉碱甲溶液至终浓度为1μmol·L－1，再加入Aβ25－35至终浓度为10μmol·L－1，终体积为200μL。YLSP 处理组：各组分别加入用无血清DMEM 低糖培养基配制的YLSP 溶液至终质量浓度为0.01，0.1，1.0μg·mL－1，再加入Aβ25－35至终浓度为10μmol·L－1，各孔终体积为200μL。将孔板置于37 ℃含5%二氧化碳的培养箱中培养24 h后，每孔加入终质量浓度0.5 mg·mL－1MTT（20μL），继续培养4 h后吸去DMEM 培养基，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振摇混匀5 min，待孔内颗粒完全溶解后，在酶标仪492 nm 处测定吸光度值［5］。根据公式计算：细胞存活率＝待测组细胞OD／空白对照组细胞OD×100%。

取培养瓶中处于对数生长期的PC12 细胞，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基将细胞稀释，以2×105个／mL细胞密度接种于孔内置有清洁盖玻片的24孔培养板，每孔500μL，放入恒温培养箱，37 ℃含5% CO2条件下培养24 h，实验共分3组：空白对照组、模型组、1.0μg·mL－1YLSP组，每组4孔。按上法（MTT 法）分组及培养，每孔保证总体积500μL，在倒置相差显微镜下（100×）观察各组PC12细胞的存活及神经突触生长情况。

2.3 透射电镜观察 将PC12 细胞以2×105个／mL接种于6孔板，每孔2 mL，当细胞的生长进入对数生长期时（约24 h），将细胞分3 组：空白对照组、模型组、1.0μg·mL－1YLSP 组，处 理24 h 后，2%戊二醛PBS固定（4 ℃），1 000 r·min－1离心10 min，PBS重悬细胞，吸入有琼脂空槽的离心管中，1 000 r·min－1离心10 min，切下尖槽内含细胞团的琼脂块，1%戊 二 醛 固 定（4 ℃），PBS 漂 洗1 次，1%锇酸后固定2 h，30%、50%、70%乙醇逐级脱水10 min，4%醋酸双氧铀快染过夜，80%、95%乙醇脱水10 min，100%乙醇脱水10 min×2次，环氧丙烷置换10 min×2次，环氧树脂梯度渗透，618环氧树脂包埋60 ℃、48 h，金刚刀超薄切片机切片，片厚70 nm，醋酸铅片染2 min，透视电镜（H－7650，HITACHI）观察、摄片。

3 结果

3.1 YLSP对Aβ25－35所致PC12细胞损伤的保护作用 由表1 可见，与空白对照组相比较，加入10 μmol·L－1Aβ25－35损伤因素后，细胞存活率显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，YLSP 各浓度组均使细胞存活率显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。

表1 YLSP对Aβ25－35所致PC12细胞损伤的保护作用±s，n＝4）Tab 1 Protective effects of YLSP on the Aβ25－35－induced cytotoxicity in PC12 cells±s，n＝4）

表1 YLSP对Aβ25－35所致PC12细胞损伤的保护作用±s，n＝4）Tab 1 Protective effects of YLSP on the Aβ25－35－induced cytotoxicity in PC12 cells±s，n＝4）

注：与空白对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，c P＜0.01

组别 浓度 细胞存活率／%00模型－59.51a石杉碱甲 1μmol·L－1 72.97c YLSP低剂量组 0.01μg·mL－1 75.05c YLSP中剂量组 0.1μg·mL－1 71.22c YLSP高剂量组 1.0μg·mL－1 68.56空白对照－100.b

倒置相差显微镜观察结果：空白对照组的PC12细胞，细胞个体饱满，突触明显，交织成网状，细胞呈现多边形、菱形或梭形，细胞长势很好，细胞的折光性正常。模型组PC12细胞可见细胞膜外围的突触回缩甚至消失，细胞浆内出现空泡，细胞聚集成团，数量明显减少，大多数细胞由多边形变成不规则形状和圆形，细胞质皱缩，体积变小，细胞的折光性变差。1.0μg·mL－1YLSP组：细胞接近空白对照组，细胞个体饱满，突触较明显，折光率较模型组好，胞浆较透亮。结果见图1。

图1 YLSP对Aβ25－35所致PC12细胞损伤的保护作用（×100）A.空白对照组；B.模型组；C.1.0μg·mL－1 YLSP组Fig 1 Protective effects of YLSP on the Aβ25－35－induced cytotoxicity in PC12 cells（×100）A.normal group；B.model group；C.1.0μg·mL－1 YLSP group

3.2 透射电镜观察结果 空白对照组：PC12细胞电子密度均匀，微绒毛发达，细胞核圆，核仁大而明显，核质分布均匀，核边缘圆滑，胞质内可见平行双层膜粗面内质网、游离核糖体、溶酶体及数量较多的线粒体，线粒体嵴清晰可见，各细胞器均结构正常清晰（图2）。模型组：细胞膜微绒毛消失，胞核核形不规则，核膜明显凹陷，核仁边聚，核质分布不均，染色质浓缩分布在核膜周围或一侧，线粒体数量明显变少，结构不清，出现了肿胀、空泡样变及嵴断裂，内质网囊腔膨胀扩张成池，但胞膜完整（图3）。1.0μg·mL－1YLSP 组：细胞接近空白对照组，细胞膜上微绒毛较空白对照组稍少，核膜略凹陷，核仁明显，核质分布均匀，线粒体数目多且形态正常，但个别粗面内质网囊腔膨胀扩大（图4）。

图2 空白对照组细胞的超微结构（A×15 000，B×30 000）Fig 2 The ultrastructure of normal cells（A×15 000，B×30 000）

4 讨论

AD 典型的神经病理学特征是老年斑（senior patch，SP）的 出 现。β－淀 粉 样 蛋 白（amyloid betaprotein，Aβ）是老年斑的主要成分，细胞外纤维化的Aβ聚集，以及细胞内Tau蛋白异常磷酸化形成神经纤维缠结（neurofibroustackles，NFT），最终形成了老年斑［6］。Aβ是由β－淀粉样蛋白前体（amyloid precursor protein，APP）裂解而成的毒性蛋白，由3943个氨基酸残基组成，其活性片段主要在第2535个氨基酸残基（GSNKGAI－IGLM），其在脑内沉积与AD 形成密切相关［7］。PC12细胞是来自大鼠嗜铬细胞瘤的细胞株，系神经嵴源性，具有神经细胞的特点，可传代培养，生长条件稳定［8］。因此，用Aβ25－35直接诱导PC12细胞凋亡以建立AD 模型，具有代表性，是体外进行AD 研究的理想模型。在本实验中，采用Aβ25－35诱导PC12细胞损伤凋亡模型，给予YLSP预处理后，MTT 比色法分析细胞存活率，倒置相差显微镜、透射电镜观察细胞形态改变，以观察药物的保护作用。MTT 法显示与空白对照组相比较，加入10μmol·L－1Aβ25－35损伤因素后，细胞存活率显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，YLSP各浓度组均使细胞存活率显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。倒置相差显微镜观察结果显示：模型组PC12细胞可见细胞膜外围的突触回缩甚至消失，细胞浆内出现空泡，细胞聚集成团，数量明显减少，大多数细胞由多边形变成不规则形状和圆形，细胞质皱缩，体积变小，细胞的折光性变差。YLSP治疗后细胞接近空白对照组，细胞个体饱满，突触较明显，折光率较模型组好，胞浆较透亮。透射电镜超微形态学观察显示模型组PC12 细胞核缩小，异染色质边集，胞浆内有大小不等的空泡状结构，溶酶体增多，伴有线粒体肿胀明显，有的嵴断裂，有的空泡变性，滑面内质网扩张，粗面内质网轻度扩张并有脱颗粒现象，YLSP 治疗后对细胞超微结构有所改善，细胞结构接近正常。

综上可知，YLSP可显著改善Aβ25－35诱导引起的PC12细胞形态的改变，减轻细胞膜的损伤，增强细胞的活力，提高神细胞的存活率，具有一定的对抗Aβ25－35诱导的PC12细胞凋亡作用。其他实验结果也显示，YLSP与清除脑内自由基及提高抗氧化能力有关［4］。提示YLSP对AD 的作用机制可能是多方面的，将其用于AD的治疗还有待于进一步的研究。

［1］ 关青，王春艳，王利群.多重干预对早中期老年性痴呆患者综合能力改善的影响［J］.中国老年学杂志，2009，29（14）：1836－1837.

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［3］ 孔晓龙，蒋伟哲，黄仁彬，等.玉郎伞对自发性高血压大鼠和SD大鼠血压的影响［J］.中草药，2001，32（8）：727－728.

［4］ 蒋伟哲，孔晓龙，段小群，等.玉郎伞对机体氧自由基清除作用的研究［J］.中国药房，2001，12（8）：453－454.

［5］ 孔晓龙，蒋伟哲，林自中.玉郎伞提取物对环磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的影响［J］.中国药房，2004，15（6）：335－336.

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［7］ Serpell LC.Alzhermer’s amyloid fibrils：structure and assembly［J］.Biochim Biophy Acta，2000，1502（1）：16－30.

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