采用正交设计法优化梨SSR-PCR体系

毕红园 王长彪 段永红 郭黄萍 孙毅，5

（1.山西大学生物工程学院，太原 030006；2.山西省农业科学院生物技术研究中心，太原 030031；3.山西农业大学农学院，太谷 030801；4.山西农科院果树研究所，太谷 030815；5.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，太原 030031）

梨属于蔷薇科（Rosaceae），梨属（Pyrus L.）植物［1］。全世界梨属植物约有60种，我国是梨属植物的起源中心，蕴藏着丰富的种质资源，原产我国的梨属植物现有18个种，7个亚种，栽培品种约有3 000多个，栽培面积和总产量在国内主要水果中均排第3位［2］。目前，随着我省农业产业结构的调整，出现了一批自有知识产权的梨树新品种和新材料，但由于市场混乱，现有的新品种得不到有效的保护和鉴定，极大地损害了相关单位和个人的利益，同时也阻碍了我省农业经济的大力发展。为此，进行梨树品种间鉴定，保证品种的真实性和纯度，维护生产者与育种者的利益就显得尤为重要。近年来，迅速发展的DNA分子标记技术为优良品种的引进，品种快速准确的鉴定和伪劣苗木的早期识别提供了有效的手段。

已有学者选用不同的分子标记技术对梨开展了研究。其中，SSR标记（Simple Sequence Repeat）是一种新兴的分子标记技术，可应用于遗传图谱的构建、基因定位、亲缘关系分析和指纹图谱构建等领域［3］。由于该标记分布于整个基因组，具有数量丰富，等位变异高，共显性，检测简单，结果稳定可靠等优点［4］，在品种鉴定等方面已到了广泛应用［5-10］。虽然已有对梨品种进行分子标记研究的报道，但尚未见报道关于梨SSR-PCR体系优化的研究，并且由于不同的梨品种所要求的体系并不完全相同，因而无法建立一个完整统一的模式。本次试验采用正交设计L16（45）方法对梨SSR-PCR反应体系的5因素（Taq DNA 聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的浓度）在4水平上进行优化，并对结果用DPS数据处理软件进行较为详细地分析，又用梨的24个品种对此体系进行检测，以期建立一个较为完整可靠的梨属SSR-PCR反应体系，为梨品种鉴定和新品种保护提供依分子生物学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

“硕丰梨”品质优良、抗寒性较强，在我省冷凉地区有较大的种植面积，因而本试验采用“硕丰梨”作为试材。该品种叶片取自山西省农科院果树研究所，采回后置于-70℃冰箱备用。引物参照NCBI网站中梨属的EST序列，经MISA软件分析，并用Primer3软件设计获得梨属SSR标记引物，该引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及浓度纯度检测 梨树总DNA提取采用改良的CTAB法［11］，在核酸蛋白检测仪（SXABRC，eppendorf-Bio-photometer）上 测 定DNA样本的浓度及纯度。用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。将DNA样品置于-20℃下保存备用。

表1 PCR反应的因素和水平

表2 PCR反应因素水平L16 （45 ）正交试验设计

1.2.2 PCR反应因素水平的确定与正交表的设计 在PCR反应中，Taq 聚合酶、Mg2+、dNTP、引物、DNA模板是影响反应的5个主要因素。为确定它们在PCR反应中的最佳水平，针对这5个因素，每个因素设4个水平，见表1，采用正交设计L16（45）进行试验［12，13］。设计方案见表2，设3次重复，共48个PCR管，按表中的数据加样；另外每管还加入1 μL的10×PCR Buffer（终浓度为1×PCR Buffer），其余用ddH2O补足，反应体系总体积为10 μL。

1.2.3 PCR扩增及其产物的检测 PCR扩增反应在东胜创新生物科技有限公司的EDC-810型基因扩增仪上进行。反应程序为：94℃预变性3 min ；94℃变性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。以上海生物工程有限公司的Marker为对照，用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，在北京六一仪器厂DYCZ-30C型电泳仪上于300 V恒压下电泳40 min，拆板后观测并拍照分析。参照刘明珍、何正文等［14］的方法，依扩增条带的敏感性和特异性进行计分，分数越高，表示扩增带的敏感性、特异性越好。

1.2.4 最佳反应体系的验证 从梨属的SSR引物中，随机选择1对引物，对梨属24个品种的DNA进行扩增，以验证优化的梨属SSR-PCR反应的稳定性。

2 结果

2.1 DNA质量检测

SSR标记虽然对DNA的质量要求不高，但如果DNA样品不纯则会影响PCR反应，使试验结果不稳定。本试验采用改良的CTAB法提取梨属DNA，所提DNA无色透明，可溶性好。用核酸检测仪检测DNA溶液纯度和浓度，经琼脂糖凝胶电泳（0.8%）检测DNA的质量，观察到条带清晰且无降解，说明提取的DNA质量高，完整性好，可用于SSR分析（图1）。

图1 24个梨品种的DNA电泳图

2.2 PCR扩增结果直观分析

2.2.1 梨SSR反应体系的优化设计及扩增结果 按照表2正交设计的16个处理组合，进行PCR反应和电泳检测，结果见图2。结果表明，5种反应因素浓度组合不同，其扩增的效果也不一。唯一相同的是16个处理组合都没有扩增出分子量小于100 bp的引物二聚体。其中2、8、14号处理组合扩增效果较差，条带不清晰且不易观察；6、15、16号处理组合扩增的条带目的条带多且容易观察。根据图片，结合遗传多样性分析的要求，将16个处理组合分别进行打分，即将条带数量丰富、清晰度高、背景低的扩增产物记为16分，而最差的记为1分。由图中1-16处理组合可知，条带数量最丰富且清晰的是6号处理组合，赋值为16，几乎无条带的13号处理赋值为1。按此方法对16个处理组合分别计分为4、3、12、13、10、16、5、2、6、7、8、9、1、11、15、14，并对不同因素与水平的电泳评分平均值和极差进行计算分析，结果如表3所示。

图2 正交体系凝胶电泳图

极差R值的大小表明各因素影响程度的高低，R越大，说明该因素对结果影响越大。因此，该体系中对结果影响的大小顺序是引物、Mg2+、dNTP、DNA模板、Taq聚合酶。其中，每一因素各水平均值大小K，反映了各因素不同水平对反应体系的影响情况，均值越大说明反应水平越好。

表3 正交设计直观分析

2.2.2 各因素浓度对梨PCR反应结果的影响 由表3可看出，Taq DNA聚合酶浓度处理组合中平均分数最低的是水平3，即Taq DNA聚合酶浓度为1.0 U时平均分值仅为7.500分；而平均分数最高的是水平4，即Taq DNA聚合酶浓度为1.4 U时平均分值最高为10.250分，说明1.4 U Taq DNA聚合酶浓度为梨PCR反应的适宜浓度。Mg2+处理组合中平均分数最低的是水平1，即Mg2+浓度为1.0 mmol/L 时平均分值为5.250分；而分数最高的是水平3，即Mg2+浓度为2.0 mmol/L 时平均分值最高为10.00分，说明2.0 mmol/L Mg2+浓度为梨PCR反应的适宜浓度。同理可得出dNTP最优浓度为0.1 mmol/L、引物最优浓度为0.5 μmol/L、DNA模板最优浓度为50 ng。

2.3 最佳反应体系稳定性检测

应用上述正交试验所获得的最佳反应体系，用1对引物对梨属24个品种的DNA进行扩增，结果如图3显示，每份DNA样品均能扩增出清晰的目的条带。说明该体系比较稳定，适用于梨属植物遗传多样性的SSR标记研究。

图3 最佳体系的24个梨品种电泳图

3 讨论

为了对梨进行遗传多样性研究，需要获得高质量的DNA。而梨的叶片中也存在大量的糖、酚类等物质，因而用传统的CTAB法所提取的梨DNA质量效果不太好，改良后的CTAB法可将细胞中的多糖，多酚去除，效果较好。

SSR分子标记技术以其便捷可操作性高，重复性高等优点，近年来在植物的种质鉴定、遗传多样性检测、亲缘关系分析和遗传图谱构建等方面得到广泛应用。但SSR-PCR 反应体系同样受到dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、DNA模板用量等因素的影响，例如，模板浓度过低会导致结果不稳定及条带模糊；浓度过高时引物与dNTPs过早耗尽，结果也不稳定。引物浓度偏高会引起碱基错配和非特异性产物的产生，形成引物二聚体。而Taq酶的浓度过高不仅增加试验成本，而且极易产生非特异性扩增产物；浓度过低则会导致产物的合成效率下降［15］。同时，Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。并且dNTP分子中的磷酸基团能定量地与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低［16］。因而确定其最优体系，对PCR反应是否成功、所得的结果是否准确，以及PCR的扩增效率都有重要的影响［17］。

传统的单因素试验筛选反应体系，需要进行多次的梯度试验，试验繁琐［18］，但是正交试验因在减少试验规模的同时又不损失信息，能更加快速找到最优组合［19］，同时也可借助于数学上的统计分析方法对试验结果进行分析与处理，获得可靠的结论，使分析结果更科学、完善和简便。不过不能忽视的是该方法也有不足，对照图片进行打分法，存在一定的主观性，因而也需要有进一步的改进。

4 结论

最终确立梨SSR-PCR最佳的反应体系（10 μL）为：1.0 μL 10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶1.4 U、Mg2+2.0 mmol/L、DNA模板50 ng、dNTPs 0.1 mmol/L、引物0.5 μmol/L。扩增程序：94℃预变性3 min ；94℃变性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。用此反应体系和扩增程序在24份梨品种材料中获得的结果清晰稳定，重复性好。因而初步确定此反应体系可用于梨属植物的PCR扩增分析。

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