疏筋解毒方对脂多糖诱导少胶质细胞不同时段形态变化的实验研究＊

王亚丽 齐 娜 梁建议 仝武宁 陕西中医学院（咸阳712046）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD），是最常见的神经系统慢性退行性疾病之一。中枢神经系统（central nervous system，CNS）缓慢进展的炎症反应可能在PD 的病理进程中扮演着重要角色，小胶质细胞作为中枢神经系统重要的免疫细胞，在这一病理过程中处于核心地位。小胶质细胞对CNS内稳态的失衡极为敏感而极易被激活。激活后，其特异性膜表面分子的表达明显上调，细胞数目大量增殖，且形态发生了显著变化，如胞体增大，细胞突起变短、变粗或消失，呈杆状、类圆形或典型的阿米巴状。激活后的小胶质细胞所产生的大量炎症介质，如一氧化氮（NO）、白细胞介素lβ（IL－1β）、肿瘤坏死因子α（TNF－α）、干扰素γ（IFN）及前列腺素E－2（PGE－2）等被认为对神经元损伤具有重要作用。多数研究表明激活的小胶质细胞可通过产生各种炎症介质来损伤神经元细胞。本研究拟开展中药复方疏筋解毒方对脂多糖诱导小胶质细胞激活形态改变的干预作用，探讨小胶质细胞的激活与帕金森病之间的内在关联性。

1 实验动物 选择清洁级健康成年SD 大鼠30只，雌雄各半，体重220±20g，合格证编号：SCXK（陕）2007－001；大鼠及标准饲料均由西安交通大学医学院实验动物中心提供，饲养条件：5只／笼，自由饮水、进食，动物房12h光、暗交替，平均温度23±1℃。将30只雌雄各半SD 大鼠分别称重、编号后，运用随机数表法分为对照组和中药组，每组15只，以制备含药血清。

选择出生24～48h的SD 乳鼠，每次实验10只，合格证编号：SCXK（陕）2007－001；提供单位同上，用于MG 的原代离体培养。

2 实验用药 疏筋解毒方主要由龟版、鸡血藤、熟地、白芍、土茯苓等十余味中药组成，购买诸药经生药学鉴定，符合2010版药典规定的质量标准。将上述药物按处方组成比例，洗净泥沙，加水浸泡1h，按照龟版先下，阿胶烊化等煎药规则，砂锅常规煎煮两次，将两次所煎药液混合浓缩成含生药1.9g／mL的水煎液，分装、密封，4℃储存备用。

图1 各组小胶质细胞不同时段的形态变化

3 含药血清及正常鼠血清制备 将30只SD 大鼠随机分组，适应饲养3d后，中药组给予疏筋解毒方中药水煎剂灌胃，2次／d，按照人与大鼠体表面积剂量换算标准［1］确定灌胃剂量（12.6g·kg－1·d－1），连续3d；对照组给予等体积的生理盐水灌胃。末次给药后禁食禁水1h，经右心室取血，静置2h，离心（4℃2000r／min 20min），分离血清，56℃灭活30min，0.22μm 滤器过滤除菌、分装，－20℃冰箱保存备用。

4 实验材料

4.1 实验细胞：采用温和消化法获得纯化的原代小胶质细胞，细胞纯度＞95%。将MG 分为：正常组、对照组及大、中、小剂量中药组5组。

4.2 实验试剂：低糖型DMEM 培养液，胎牛血清，正常鼠血清，含药血清，双抗，1μg／mLLPS溶液，0.002%多聚赖氨酸PDL，0.1M PBS缓冲液，0.01M PBS，丙酮，一抗（CD11b／c克隆号：OX－42），SP免疫组化检测试剂盒，DAB显色试剂盒，苏木素，中性树脂。

4.3 实验仪器：超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜，荧光显微镜，高速冷冻离心机，细胞计数板，离心管，弯头吸管，24孔细胞培养板等。

5 实验方法及步骤

5.1 细胞爬片：收集纯化的MG，细胞计数，浓度为1×105／mL接种于24孔培养板中（预先置有0.002%PDL 处理过的1／4盖玻片），500μL／孔，分为正常组、对照组及大、中、小剂量中药组，共5组；其中正常组设4孔，余每组各设3孔，CO2培养箱中适应性培养24h之后，每孔吸除50μL 的细胞上清，对应补加正常鼠血清及大中小剂量的混合血清50μL／孔，则各组细胞中的培养液可视为血清终浓度为10%的完全培养液，其中正常组与对照组为10%正常鼠血清的完全培养液，大、中、小剂量中药组则分别为含药血清浓度为10%、5%、0.5%的完全培养液。

5.2 在加入正常鼠血清及含药血清混合液30min后，加入终浓度为1μg／mL 的LPS，分别于加入血清作用12h、24h、36h、48h之后，取出细胞爬片，将培养好的细胞爬片于湿盒中进行免疫组化染色。后中性树脂封片，观察、摄像。

6 结果 疏筋解毒方对于不同时段MG 形态变化的影响，见图1。由表中的图片可看出：正常组的小胶质细胞形态较稳定，其胞体呈扁椭圆形或三角形，大多细胞只有一个纤细突起，而再无其它分支（较在体的MG 不同），形似蝌蚪。小胶质细胞特异性免疫组化着色在48h明显变浅，表明其细胞膜分子CR3（可与OX－42特异性结合）表达下调，细胞活性欠佳。与正常组相比，对照组中MG 数量有所增加，在12h其胞体明显变大呈椭圆形，部分细胞突起明显短粗，呈现典型的阿米巴状，部分细胞无突起，免疫组化着色明显加深；24h之后，MG 胞体更加肿胀，48h大多细胞几乎裂解死亡，由此可见终浓度为1μg.mL－1的LPS可诱导小胶质细胞出现明显的形态学变化。与对照组比较，小、中剂量组的MG 着色相对较浅，胞体相对较小，细胞肿胀、裂解的程度有所减轻，且时间相对推后；大剂量组相对于对照组而言，不仅胞体小多呈杆状，且细胞突起的存在较为明显，仅少数细胞出现肿胀、裂解情况，大多细胞仍保持完整的形态，部分细胞似乎有向静息状态转变的可能。

7 讨 论 小胶质细胞在生理情况下，处于静息状态。其在CNS中介导炎症反应的免疫细胞类型中居于核心地位，对周围微环境的变化极其敏感，极易被激活。况且，中脑黑质区发生氧化应激的几率较其他区域显著；而MG 在此处分布密集、其被激活后便成为大量超氧化物等自由基产生的主要来源；加之，DA 能神经元较其他类型的神经元更易受到自由基的损伤［2］。由此可见，MG 的激活与PD 的发病密切相关，且其激活的程度与多巴胺能神经元的损伤程度及帕金森病的病程进展之间存在一定的联系［3］。

LPS是一种强效炎症反应诱导剂，可与MG 上的脂多糖结合蛋白结合，能够激活MG 表达和释放多种细胞因子和细胞毒性物质，发挥其毒性作用［4］。诸多研究表明，LPS模拟的是炎症损伤机制造成的慢性进行性神经变性过程，符合PD 的渐进性变性进程。激活的MG 会导致其膜表面分子Ⅲ型补体受体的增加，并能与OX－42特异性结合，此二者的结合作为对MG的特异性标记已为研究领域广泛认可。本实验结果表明，脂多糖可有效刺激原代培养的小胶质细胞增殖、活化，同时也能使其形态学发生改变，并促进其快速凋亡。在自身免疫或过度炎症反应等病理情况下，抑制小胶质细胞的活化与增殖，促进其向静息状态转变或快速死亡对于保护神经细胞免受氧化应激等损伤是非常有益的。分析本实验对照组经LPS刺激，MG 在大量显著活化的同时也伴随其自身的快速裂解死亡，这可能与LPS工作浓度较大、毒性作用较强有关，也不排除MG 激活后分泌产生大量的炎症介质不仅会对神经元细胞造成损伤，同时对其自身亦造成严重的损害。疏筋解毒方各含药血清组对LPS诱导MG 的激活有不同程度的抑制作用，尤其是大剂量组的有效性较为明显：本组激活的MG 形态介于过度激活状态与静息状态之间，到实验后期其细胞碎裂程度较各组尤其是对照组有所改善，部分细胞形态趋于静息形态。由此推断疏筋解毒方抑制MG 的活化可能与其能减缓激活MG 自身快速死亡而促进其向静息形态转变的作用相关。

8 结 论 本课题组以中医理论为基础，结合帕金森病的病证特点及现代中医药对本病治疗的研究进展以及多年的临床经验，从补益肝肾及活血解毒两个角度立法处方，总结研制出中药复方—疏筋解毒方。该方主要由鸡血藤、龟版、熟地黄、白芍、阿胶、全蝎及生甘草等十余味中药组成。主要功效：疏筋通络解毒，滋阴养血熄风。

本研究表明疏筋解毒方对激活MG 的形态具有一定的影响作用，可能有减缓激活小胶质细胞自身快速死亡而促进其向静息形态转变的作用。从形态学上表明该方可通过阻抑MG的激活以达到神经保护的作用。这为进一步研究疏筋解毒方治疗帕金森病提供了较有价值的思路和依据。

［1］ 徐淑云.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2001：37.

［2］ Greenamyre JT，MacKenzie GM，Peng TI，et al.Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease［J］.Bioehem Soc Symp.1999，66：85－97.

［3］ Ouchi Y，Yagi S，Yokokura M，et al.Neuroinflammation in the living brian of Parkinson’s disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2009，15：200－204.

［4］ Jeohn GH，Cooper CL，Wilson B，et al p38 MAP kinase is involved in lipopolysaccharide－induced dopaminerg ic neuronal cell death in rat mesencephalic neurorr glia cultures［J］.Ann N Y Acad Sci，2002，962：332－346.