血复生胶囊质量标准研究

杨 静 万峰峰 蔡慧侠 杨飞快 西安金花制药厂（西安710065）

血复生胶囊为中药复方制剂，是由黄芪、白芍、女贞子、当归、川芎、大黄、山药、茯苓等16味药材加工制备而成。具有益气养阴血、滋阴凉血、化瘀解毒的功效。用于气血两虚、阴虚津亏、止汗盗汗、烦躁失眠、出血紫斑等恶性贫血，癌症放化疗后的血象异常，尤其对白细胞减少症有明显的升高或调整血象的作用。白细胞减少症从中医辨证乃属“眩晕”、”虚劳”。黄芪、当归、女贞子等均有升白作用。为了有效地控制药品质量，本实验采用薄层色谱（TLC）法对制剂中的女贞子、黄芪、当归、川芎、大黄进行定性鉴别，采用显微鉴别法对山药、茯苓显微鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法对白芍中的芍药苷进行含量测定［1］，获得满意效果。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 P608 HPLC Pμmp，μVD17μ 检测器，Chromeleon工作站，自动进样器（美国戴安公司），AL204－IC 型电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）、BP211D 型电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）。

1.2 试药 芍药苷对照品（批110736－201023，供含量测定用）、女贞子对照药材（批号：1041－201001，供鉴别用）、黄芪对照药材（批号：120974－201006，供鉴别用）、当归对照药材（批号：9271－200910，供鉴别用）、川芎对照药材（批号：120918－200906，供鉴别用）、大黄酚对照品（批号分别为796－200904，供含量测定用）均购自中国药品生物制品检定所；血复生胶囊，购自黑龙江省完达山制药厂；硅胶G 购自青岛海洋化工厂；试剂：乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯（西安化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 取本品内容物置显微镜下观察：淀粉粒三角状卵形或距圆形，直径24～40μm，脐点短缝状或人字状。不规则分枝状团块无色，遇水合氯醛液溶化；菌丝无色或淡棕色，直径4～6μm。

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1女贞子的薄层鉴别 取本品15粒内容物，研细，加三氯甲烷60mL，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液。取血复生胶囊去女贞子的阴性样品15粒，同法制成去女贞子的阴性样品溶液。另取女贞子对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述三种溶液各10～15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以环己烷－乙酸乙酯－丙酮（5∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。

2.2.2 黄芪的薄层鉴别 取本品20粒内容物，研细，加乙醇30mL，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加0.3%氢氧化钠溶液15mL使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节pH 值至5～6，用乙酸乙酯15mL 提取，分取乙酸乙酯液，用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干。残渣加乙酸乙酯1mL 使溶解，作为供试品溶液。取血复生胶囊去黄芪的阴性样品15粒，同法制成去黄芪的阴性样品溶液。另取黄芪对照药材，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷－甲醇（10∶1）作为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，阴性无干扰。

2.2.3 当归和川芎的薄层鉴别 取本品20粒的内容物，研细，加乙醚100mL，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。取血复生胶囊去当归和川芎的阴性样品20粒，同法制成去当归和川芎的阴性样品溶液。另取当归对照药材和川芎对照药材各1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述四种溶液各10～15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以正己烷－乙酸乙酯（8∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯光（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

2.2.4 大黄的薄层鉴别 取本品20粒内容物，研细，加甲醇30mL，超声60min，滤过，取滤液10mL，蒸干，残渣加水10mL使溶解，再加盐酸1mL，水浴加热30min，立即冷却，用乙醚提取2次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液。取血复生胶囊去大黄的阴性样品20粒，同法制成去大黄的阴性样品溶液。另取大黄对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。再取大黄酚对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述四种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H 薄层板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

2.3芍药苷的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Lichrospher－C18（4.6×250mm，5μm）（江苏汉邦科技有限公司）；流动相：乙腈－0.1%磷酸（15：85）；流速：1mL／min；柱温：室温；检测波长：230nm。进样量：10μl［2］。在选定条件下，芍药苷与其它组分色谱峰可达基线分离，且与相邻色谱峰分离度大于1.5，且理论塔板数不小于2000。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36h的芍药苷对照品适量，加甲醇制成每lmL 含50μg的溶液，取续滤液，作为对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品20 粒内容物，精密称定，研细，取细粉约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.3.4 阴性样品溶液的制备 取除白芍外的其它处方量药材，按制备工艺方法制备缺白芍的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺白芍的阴性样品溶液。

2.3.5 测定及结果 分别精密上述对照品溶液、阴性样品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。结果表明，色谱行为良好，各色谱峰均达基线分离，供试品色谱中，在与对照品色谱峰相应的位置上检出色谱峰，而缺白芍的阴性样品溶液色谱中无色谱峰，说明阴性样品无干扰。

2.3.6 标准曲线的绘制： 取芍药苷对照品溶液（76.2ug／mL），精密吸取1μl，3μl，5μl，10μl，20μl注入高效液相色谱仪中，按照上述色谱条件测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标X，平均峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线并计算回归方程为：Y＝22.29864X－0.36812，r＝0.9999，芍药苷在0.0762～1.5240ug范围内线性关系良好。

2.3.7 精密度试验 精密吸取样品溶液10μl，连续重复进样5次，测定峰面积，测得芍药苷峰面积计算RSD 为0.19%，表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、8h 测定，进样量10μl。测得芍药苷峰面积计算RSD 求得为0.25%。结果表明，供试品溶液在8h内稳定性良好。

2.3.9 重复性试验 取同一样品批号（20040501）5份，分别按上述含量测定方法测定其芍药苷含量，测得芍药苷RSD为0.28%。结果表明，本法重现性良好。

2.3.10 回收率试验 采用加样回收法，称取已知含量的供试品（批号：20040501，含量：0.188mg／粒）9份，各精密加入黄芩芍药苷对照品溶液（0.63mg／mL）1mL，按供试品制备方法和测定条件进行测定，得芍药苷平均回收率为99.42%，RSD＝0.3%。见表1。

表1 黄芩苷回收率实验结果

2.3.11 样品含量测定 按上述条件和方法测定3批样品中芍药苷含量，结果分别为0.188、0.191、0.175mg／粒，考虑到药材的来源，以及生产、储藏等因素，故暂定本品每粒中含芍药苷（C23H28O11）计，不得少于0.15mg。

3 小结与讨论

芍药苷是该制剂中白芍的主要成分，采用HPLC法测定该制剂中芍药苷的含量可作为此制剂的质量标准控制指标［4］。

在对供试品提取条件的确定过程中，曾比较了回流提取法、超声提取法2种提取方法，并比较了甲醇、乙醇2种溶剂，结果表明，采用超声提取法以甲醇做提取溶剂所制得供试品，杂质含量少且待测成分含量高，故确定以甲醇为提取溶剂采用超声提取法进行样品的提取；进一步试验比较了溶剂用量（10mL，20mL，30mL）、溶剂浓度（30%，50%，100%）及超声时间（15min，30min，45min）。最终确定溶剂用量为20mL，溶剂浓度为50%，超声时间为30min［3，4］。

试验结果表明，本方法专属性强、重现性好、精密度、回收率都较满意，因此可作为血复生胶囊的质量控制。

［1］ 国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：化学工业出版社2010：1.

［2］ 刘素文，高明焕，郭艳霞.三白通络胶囊质量控制标准研究［J］.河北中医，2008，30（02）：206－208.

［3］ 惠婷婷，夏忠庭，张兰兰，等.HPLC测定郁舒颗粒芍药内酯苷和芍药苷的含量［J］.陕西中医，2012，31（04）：480－481.

［4］ 李雪晴，王 超，文爱东.HPLC 法测定益胃颗粒中芍药苷的含量［J］.陕西中医，2010，29（06）：737－738.