扶正泄浊保肾汤对肾功能衰竭大鼠肾组织smad4、smad7表达的影响＊

马居里 耿翠翠 朱海慧 严惠芳 白 洁 应小平 冷 伟 张 宾 李 媛 杨 智

陕西中医学院（咸阳712045）

慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）简称慢性肾衰，是各种慢性肾脏疾病，引起肾功能和肾单位缓慢进行性不可逆的丧失，导致以代谢产物和毒性产物潴留、水电解质和酸碱平衡紊乱以及内分泌失调为特征的临床综合征。扶正泄浊保肾汤为陕西省名中医马居里教授的临床经验方，该方对早、中期慢性肾功能衰竭有较好的疗效，既往有实验研究表明该方具有降低肾衰大鼠Cr、BUN、血清瘦素作用。本实验通过观察该方对慢性肾衰大鼠肾组织中Smad4、Smad7信号蛋白治疗前后表达的影响，探讨其抗肾间质纤维化、延缓CRF进展的机制。

1 材料与方法

1.1 实验用药及试剂 腺嘌呤（Adenine，C5H5N5），批号082013，上海丽珠东风生物技术有限公司生产；氯沙坦钾（科素亚），批号110020，杭州默沙东制药有限公司生产；扶正泄浊保肾汤（虫草菌粉、黄芪、生晒参、苍术、熟地黄、当归、山药、半夏、橘红、茯苓、枳实、大黄、水蛭、车前子等），药材购于陕中附院中药房，由陕西中医学院药理实验室制成浓缩液。Smad4试剂盒：批号BA1397，购于武汉博士德生物工程有限公司；Smad7试剂盒：批号990779W，购于北京博奥森生物有限公司；山羊抗兔（II抗）：批号CW0103，购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 实验动物模型及分组 健康SD 雄性大鼠50只，5周龄，体重200±10g，由西安市沣渭新区实验动物中心提供，合格证号：SCXK（陕）2007－001，适应1周后，随机分成2组：空白组（10只）、造模组（40只）。按200mg／kg·d 剂量将腺嘌呤制成混悬液1mL，每日晨8时给造模组大鼠灌胃喂药［1］。造模全程24d，前12d，每日给药1次；第13 天开始，隔日给药1次。空白组不干预。造模后，将40只大鼠随机分为模型组、科素亚组（5mg／kg）、扶正泄浊保肾汤高、低剂量组（37.6g／kg、18.8g／kg），每组10 只。

1.3 给药方法及喂养 实验第25天开始，根据文献［6］大鼠用量按人与动物体表面积的等效比值表折算给药量。各治疗组每日晨8时给予相应药物灌胃（10mL／kg），空白组和模型组各予生理盐水，共治疗30d。整个实验过程中大鼠均自由摄食和饮用自来水，室温控制在19～22℃，相对湿度维持在60%～70% 。

1.4 标本采集 于实验第54d晨8时至次日晨8时，收集各组大鼠24h尿液，备测24h尿蛋白定量；后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪开胸腹腔，心脏取血5mL，备测BUN、Cr；处死大鼠，摘取肾脏，置10%的福尔马林溶液中固定，送病检。

1.5 图像分析 采用分析测量图象软件Imagepro－Plus分别对各组免疫组化染色的肾脏标本切片进行测量。通过光学显微镜摄取图像，输入图像分析软件内，进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。对每组切片随机选取15个不重叠视野，计算阳性面积和整个视野面积的比值（去除肾血管腔所占面积），取其平均值进行比较。

2 实验结果

2.1 一般情况观察 空白组大鼠摄食量随体重渐增，反应灵敏、好动，体毛光滑、有光泽，耳廓、眼睑结膜红润，舌质红，舌下静脉无曲张，尾巴皮温可，外阴周围干燥，二便正常。模型组至灌服腺嘌呤起，大鼠逐渐出现体重增加较慢或减轻，摄食减少，精神萎靡，弓背蜷缩、腹部膨隆、喜卧懒动，体毛明显脱落、干枯少泽，耳廓、眼睑结膜苍白，舌质暗、有明显瘀血象，尾巴皮肤发凉，外阴周围有湿毛，大便溏、小便先增多后减少。随着治疗时间的延长，各治疗组大鼠症状均有不同程度的改善。中药高剂量组症状改善最为明显；中药低剂量组和科素亚组症状改善程度相当。实验全程死亡2只大鼠，造模过程中无大鼠死亡，在治疗过程中模型组死亡1只，中药低剂量组意外（灌入气管）死亡1只。其余各组如数存活。

2.2 各组大鼠Scr、BUN 及24h尿蛋白定量检测结果 见表1。

表1 各组大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白定量结果（±s）

表1 各组大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白定量结果（±s）

注：与空白组比较△P＜0.01；与模型组比较▲P＜0.01；与中药高剂量组比较◇P＜0.05；与中药低剂量组比较◆P＞0.05。

组 别n（只）Scr（umol／L）BUN（mmol／L）尿蛋白定量（g／24h）10 56.7±10.22 7.92±1.42 4.53±0.67模型组9 165.33±12.24△18.12±1.98△8.39±0.99△中药高剂量组10 83.80±10.58▲9.79±1.21▲5.37±1.09▲中药低剂量组9 98.89±15.97▲◇11.48±1.39▲◇6.07±1.04▲◇科素亚组10 101.7±9.67▲◇◆11.81±1.25▲◇◆6.23±0.74空白组▲◇◆

2.3 肾组织Smad4、Smad7 蛋白的表达 见表2。免疫组化阳性表现呈黄褐色颗粒状；Smad4蛋白主要在大鼠肾小球细胞胞浆内和肾小管上皮细胞内表达；Samd7蛋白主要在肾小球细胞胞浆内表达，肾小管可见少量表达；空白组Smad4呈弱阳性表达；Samd7呈强阳性表达。模型组Smad4表达较空白组均明显增强；而Smad7表达较空白组明显减弱。中药高、低剂量组、科素亚组Smad4表达较模型组明显减弱，其中以中药高剂量组表达减弱最明显，中药低剂量组和科素亚组表达程度相当。而中药高、低剂量组、科素亚组Smad7表达较模型组明显增强；其中以中药高剂量组表达增强为著，中药低剂量组、科素亚组表达程度相当。

2.4 病理（HE染色） 空白组大鼠肾小球、肾小管、间质均正常。模型组大鼠肾小球数量减少，部分肾小球萎缩；近曲小管上皮细胞可见灶状、片状坏死，内有淋巴细胞浸润，肾小管内可见颗粒管型，部分肾小管囊状扩张；间质纤维结缔组织增生较明显，血管未见异常。科素亚组大鼠肾小球数量轻度减少，少量肾小球萎缩；近曲小管上皮细胞可见灶状坏死，内有淋巴细胞浸润，肾小管管腔内见少量脱落的上皮细胞及管型，偶见肾小管囊状扩张；间质纤维结缔组织轻度增生，血管未见异常。中药低剂量组病变与科素亚组差异不大。中药高剂量组大鼠肾小球数量无明显减少，偶见肾小球萎缩；肾小管无明显病变，管腔内偶见管型；间质纤维结缔组织增生不明显，血管未见异常。

表2 各组大鼠Smad4、Smad7半定量结果（±s，%）

表2 各组大鼠Smad4、Smad7半定量结果（±s，%）

注：与空白组比较△P＜0.01；与模型组比较▲P＜0.01；与中药高剂量组比较◇P＜0.05；与中药低剂量组比较◆P＞0.05。

组 别n（只）Smad4Smad7空白组10 1.34±0.17 4.70±0.69模型组9 4.31±1.0△1.84±0.59△中药高剂量组 10 2.46±0.51▲ 3.44±0.90▲中药低剂量组9 3.62±0.87▲◇ 3.08±0.73▲◇科素亚组10 3.62±0.96▲◇◆2.80±0.93▲◇◆

3 讨 论

Smads蛋白家族是近年来发现的新的细胞内信号转导蛋白，按其结构和功能分为3个不同的亚族：一是受体激活Smad（R－Smad），包括Smad1、2、3、5 和Smad8；二是共同通路Smad（Co－Smad），目前研究只发现Smad4；三是抑制性Smad（ISmad），包括Smad6和Smad7。研究发现Sand2、3、4、7均参与TGF－β／Samd信号转导。医学公认TGF－β是最主要的致纤维化因子，它参与肾间质纤维化的各个环节，是导致肾功能衰竭的主要病理机制［3］，但由于TGF－β的多效性，抗TGF－β治疗可能引起其它潜在的生物效应，采取针对TGF－β下游因子（如结缔组织生长因子（CTGF）、Smad4、Smad7和细胞外基质黏附蛋白（βig－h3））生物学效应的药物可能是相对安全并有效减轻和延缓间质纤维化的新途径［4］。许多中药或者中药复方制剂对肾间质纤维化影响的研究已经达到分子水平，大量的临床及动物实验已经证明，一些中药通过干预TGF－β／Smad信号转导通路起到抗纤维化作用［5］。

慢性肾衰的中医病机多为脾肾衰败、气血阴阳亏损，湿、浊、瘀、毒诸邪蕴结三焦所致。临床表现往往虚实互见、错综复杂、变化多端，辨证治疗上亦感棘手。马居里教授依据“扶正固本，祛邪治标”、“扶正不恋邪，祛邪不伤正”的治疗原则，顾及该病的病理特点，建立了以补脾益肾，祛湿化浊，解毒活血通络的扶正泄浊保肾汤。该方中以虫草菌粉、生晒参、黄芪、山药、白术、茯苓补脾益肾，平调阴阳；橘红、半夏、车前子、枳实、大黄理气降逆和胃，祛湿化浊以解毒；熟地黄、当归、水蛭补血活血通络。从现代药理学研究分析，该方中黄芪、当归、虫草［3］、大黄、水蛭均据用抗纤维化的作用。本实验结果表明扶正泄浊保肾汤能改善肾衰大鼠的一般情况；降低血清BUN、Cr、24h尿蛋白定量，改善肾功能；抑制Smad4蛋白阳性表达，促进Smad7蛋白阳性表达，进而抑制肾组织纤维化进展。实验结果还表明扶正泄浊保肾汤高剂量对大鼠肾组织Smad蛋白的表达影响较低剂量组和科素亚组明显，病理改变也比低剂量组轻，有一定剂量相关，但本实验扶正泄浊保肾汤仅设两个剂量组，尚不能完全说明高剂量为治疗慢性肾衰竭的有效剂量，关于扶正泄浊保肾汤的有效剂量范围和量效关系有待于进一步实验；扶正泄浊保肾汤方中单药物是否对Smad蛋白有一定的调节作用也有待于我们研究。

［1］ 傅晓晴，林若勤，武一曼，等.腺嘌呤制作肾阳虚型慢性肾功能衰竭大鼠模型的生化研究［J］.福建中医学院学报，2003，2（13）：22－24.

［2］ 施新猷.现代医学实验动物学［M］.北京：人民军医出版社，2000，145－146.

［3］ 龚 伟，郑敬民.转化生长因子－β［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，2004，13（6）：554－556.

［4］ Wang W，Koka V，Lan HY.Transforming growth factor－bata and smad signalingin kidney diseases.Nephrology（carlton），2005，10（1）：48－56.

［5］ 刘 锂，张佩青.TGF－β／Smad信号转导通路在肾纤维化中的作用机制及中药的干预作用［J］.中医药信息，2007，24（2）：45－47.