几种中国栽培灵芝品种的RAPD 及rDNA 分子标记鉴定

黄 浩，许国权，周世力

（江汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430056）

灵芝（Ganodermalucidum）是一种著名的药用真菌，对其生物学功能的研究推动了灵芝产业的发展，我国真菌登记分类还未成体系，因为菌种问题而造成了管理混乱、产品质量不稳定等问题［1］。传统的分类鉴定主要依据子实体的形态学特征来进行，但是由于生长条件的不同导致子实体的形态学特征发生变化，一些鉴别性特征在不同种属间的差异较小，这是传统分类学的一个弊端［2］。近年来，在分子水平上对灵芝分类研究已经取得了不少进展，J.M.Moncalvo 等［3］通过rDNA的ITS 序列和25SrDNA D2 变异区序列对灵芝科的菌株进行了分类研究，鉴定了4 个系统发育学上的相关族（relatedclusters）。苏春丽等［4］利用β－微管蛋白基因部分序列探讨灵芝属菌株的亲缘关系。唐传红等［5］利用RAPD 和酯酶同工酶技术对来自国内外的10 个灵芝属代表菌株进行了遗传多样性分析。其中RAPD 分析主要用于种间亲缘关系的研究和分类鉴定，在灵芝属中的研究较少［6］。ITS 序列分析在真菌属内种间的系统发育研究中应用较为广泛［7］。更为保守的18SrDNA则主要应用于目、科、属等分类元阶［8］。目前，中国常见的灵芝栽培品种多以商品名命名，具体分类学还不明确，品种鉴定也单方面侧重于RAPD［9］或ITS 分子标记技术，每种方法都有其局限性，笔者尝试将RAPD 与rDNA 上的ITS 序列和18SrDNA 片段分子标记技术结合起来，比较之间的结果，分析可能存在的差异，为精确探索灵芝分类提供一些借鉴。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 由江汉大学食用菌栽培实验室提供6 个灵芝菌种，分别为甜芝、紫芝、黑芝、血芝、云芝和韩芝（见表1）。

表1 供试菌株

1.1.2 培养基 马铃薯固体培养基，马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂糖0.8%。

1.1.3 主要试剂和仪器 真菌基因组提取试剂盒（BioFlux）；PCR 反应试剂盒（Fermentas）；DNA 割胶回收试剂盒（BioFlux）；连接反应体系（Promega）；质粒提取试剂盒（BioFlux）；冷冻离心机（Eppendorf）；PCR 仪（Eppendorf）。

1.1.4 引物 RAPD 分析所用的10 碱基SBS 系列随机引物购自上海赛百盛公司，ITS 和18SrDNA分析所用的引物ITS1/ITS4 和NS5/NS6 均购自上海生工公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌丝体培养和基因组提取 灵芝的菌丝体于28 ℃固体培养基培养10 d。收集菌丝，－20 ℃下保存备用。DNA 提取参照唐传红等［10］的方法进行，得到的DNA 溶液在1 %的琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.2.2 RAPD 多态性分析 PCR 扩增仪为PTC－100 型。PCR 反应体系：10×Buffer 5μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，随机引物2 μL，模板1μL，Taq聚合酶0.5 μL，dd H2O 定容至50 μL。反应参数为：94 ℃条件模板DNA 变性5 min，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循环扩增40 次，最后在72 ℃条件下进行延伸7 min，于4 ℃结束反应。取5 μL 的扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳（5 V/cm）30 min，EB 染色后置于凝胶成像系统照相。通过对80 个随机引物进行RAPD分析，筛选出12 个能有效扩增且稳定性较好的随机引物（见表2）用于进一步分析。

1.2.3 ITS－PCR 扩增 扩增体系为：10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，ITS1/ITS4 引物各1 μL，模板1μL，Taq 聚合酶0.5 μL，dd H2O 定容至50 μL。反应参数为：94 ℃条件模板DNA 变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环扩增30 次，最后在72 ℃条件下进行延伸7 min，于4 ℃结束反应。

表2 随机引物编号及核苷酸序列（5′一3′）

1.2.4 18SrDNA 片段的扩增 扩增体系为：10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，NS5/NS6 引物各1 μL，模板1 μL，Taq 聚合酶0.5 μL，dd H2O定容至50 μL。反应参数为：94 ℃条件模板DNA变性5 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环扩增30 次，最后在72 ℃条件下进行延伸7 min，于4 ℃结束反应。

1.2.5 rDNA ITS 片段和18SrDNA 片段的序列测定 ITS 扩增产物通过DNA 凝胶回收试剂盒纯化，用Promega 的pGEM－T Easy Vector连接，转化于大肠埃希菌DH 5α菌株感受态细胞，经蓝白斑筛选和PCR 鉴定后，每个样品随机挑选1 个阳性单克隆株测序。

1.3 数据统计与分析方法

RAPD 数据分析：定义RAPD－PCR 图谱中不同分子量的DNA 条带为多态性状，有性状记为1，无性状记为0，并转换为对应数字矩阵。用NTSYSpc2.1 版软件包（Exeter Software：Setauket，NY，USA），UPGMA 法聚类分析，获得亲缘关系树状图。

2 结果与分析

2.1 RAPD 多态性分析

用筛选出的12 个随机引物对6 种供试材料进行RAPD 多态性分析。结果显示，引物与供试材料在不同对应水平上的扩增效果均存在差异，（图1）。每一引物对每种供试材料扩增的条带数介于0～15 条，DNA 片段的大小介于0.2～2.0 kb，12 个引物对6 种供试材料扩增产生近91 条DNA片段。这些数据用于对6 种灵芝菌株进行相似性分析并构建亲缘关系树。

图1 6 种灵芝菌株的RAPD-PCR 图谱

2.2 聚类分析

依照1.3 的方法，将6 种灵芝分析获得的RAPD－PCR 图谱转换为数字矩阵，计算对应分离菌株间的Dice 相似系数，得出6 种灵芝菌株的平均遗传距离矩阵（见表3），6 种灵芝菌株两两间的相似性系数为0. 396～0. 747。其中Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 的相似系数最高，达0. 747；而Xuezhi 和Coriolusversicolor 的相似系数最低，为0.396。用UPGMA 法进行聚类分析。结果显示，6 种菌株在相似性系数为0. 584 的水平上聚为3 类：Ganodermaluidun、Ganodermaluidum-HG、Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 为一类；Xuezhi和Coriolusversicolor各单归为一类。

表3 6 种灵芝菌株的平均遗传相似性距离矩阵

2.3 18SrDNA 序列分析

6 种灵芝菌株的18SrDNA 扩增片段，其测序结果通过DNASTAR 软件包中的MegAlign 程序进行序列分析（见图2）。结果表明，不同灵芝菌株间相似性都比较高（97.1%～99.6%），其中Xuezhi和GanodermaluidumHG 相似性最高，达99. 6 %；在较低相似性水平上，6 种灵芝菌株可分为3 类，Ganodermaluidun、Ganodermaatrum 和Coriolusversicolor归为一类，GanodermaluidumHG 和Xuezhi归为一类，Ganodermasinenses单归为一类。

图2 6 种灵芝菌株的18SrDNA 序列比较的系统进化树

2.4 ITS 序列分析

4 种灵芝菌株的ITS 片段测序成功，测序结果通过DNASTAR 软件包中的MegAlign 程序进行序列分析（见图3）。结果表明，灵芝菌株间相似性较低（43. 8 %～88. 0 %），其中Ganodermasinenses 和Xuezhi 相似性最低，为43. 8 %；在较低相似性水平上，Ganodermaluidun 和Ganodermasinenses 归为一类，Coriolusversicolor 和Xuezhi 各单归为一类。

图3 4 种灵芝菌株的ITS 序列比较的系统进化树

3 讨论

RAPD 在真菌分类研究中已有广泛的应用，据不完全统计，RAPD 已在链格孢属（Alternaria）、葡萄孢属（Botrytis）、发癣菌属（Tnchophyton）、芽枝霉属（Cladosporium）、炭疽菌属（Colletotrichum）、顶囊壳属（Gaeumannomyces）、组织胞浆菌属（Histoplasma）、球腔菌属（Mycosphaerella）、茎点霉属（Phoma）、侧耳属（Pleurotus）、丝核菌属（Rhizoctonia）、腥黑粉菌属（Tilletia）等50 余个属的种类区分或疑难种鉴定上得到应用［9］。RAPD 技术已经成功用于一些灵芝属不同种的区分，赵明文等［6］利用RAPD 技术对生产中常用的灵芝属8 个菌株的亲缘关系进行了分析，结果与经典分类结果基本相符。唐传红等［10］也证实了RAPD 可用于灵芝属内甚至种内的鉴定。本研究中，通过优化筛选12 个随机引物对6 个菌株进行RAPD 分析，结果显示，6 种菌株在相似性系数为0. 584 的水平上聚为3 类：Ganodermaluidun、GanodermaluidumHG、Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 为一类；Xuezhi 和Coriolusversicolor 各单归为一类。

ITS 序列分析是真菌分类研究中最常用方法之一。J. M. Moncalvo 等［3］和B. J. Smith 等［11］通过ITS 序列分析对灵芝属菌株进行了一些分类研究，证实了ITS 序列分析是一种有效方法。在本研究中，ITS 序列分析的3 个类群（Ganodermaluidun/Ganodermasinenses、Coriolusversicolor 和Xuezhi）与RAPD 分析的3 个类群（Ganodermaluidun/GanodermaluidumHG/Ganodermasinenses/Ganodermaatrum、Coriolusversicolor 和Xuezhi）基本一致，其中，属于多孔菌科云芝属的Coriolusversicolor 与属于灵芝属的Ganodermaluidun、Ganodermaluidum-HG、Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 与传统形态学分类基本一致，而分类地位不明的Xuezhi与其他菌株差异性较大，说明Xuezhi 应属于灵芝属与云芝属以外其他属类。

目前普遍认为18SrDNA 可用于科级以上水平的系统发育分析，如邓旺秋等［12］以短裙竹荪和白鬼笔作为鬼笔目的代表种，将其部分18SrDNA序列与担子菌门其他科目12 个代表种已知的相关序列进行对比分析，构建系统树，探讨鬼笔目在系统分类学中的地位及其亲缘关系。考虑到某些物种的18SrDNA 可能具有其他物种所没有的高度变异扩展区，而这些区域又是用于近缘种间关系分析与分类的关键，因此有学者认为，在亚族和属的水平上处理系统关系也能得出理想结果［13］，如余知和等［14］利用18SrRNA 基因核苷酸序列分析方法探讨了晶杯菌科粒毛盘菌属及其相关属间的系统发育关系。据此，本研究尝试对分属于灵芝属（Ganodermaluidun、Ganodermaatrum、GanodermaluidumHG 和Ganodermasinenses）、云芝属（Coriolusversicolor）和分类地位不明的Xuezhi 6种菌株进行18SrDNA 序列分析，结果显示，在较低相似性水平上，6 种灵芝菌株可分为3 类，Ganodermaluidun、Ganodermaatrum 和Coriolusversicolor归为一类，GanodermaluidumHG 和Xuezhi归为一类，Ganodermasinenses单归为一类。18SrDNA分析的3 个分类群与另外两种方法的分析结果有很大差异，可以说明，18SrDNA 并不太适合灵芝属属内和属间的分类研究。不可否认，RAPD 和ITS 分子标记各自也存在一些缺点，但在本研究两者分析结果基本一致的基础上，可以考虑在灵芝属的分类研究中将两种技术结合起来，较之于单一技术，会更接近于实际情况。

［1］ Hseu R S，Wang H H，Wang H F，et al. Differentiation and grouping of isolates of the Ganodermalucidum complex by random amplifiedpolymorphic DNA—PCR compared with grouping onthe basis of internal transcribed spacer sequences［J］. Appl Environ Microbiol，1996，62：1354－1363.

［2］ 苏春丽，唐传红，张劲松，等.基于rDNA ITS 序列探讨中国栽培灵芝菌株的亲缘关系［J］. 微生物学报，2007，47（1）：11－16.

［3］ Moncalvo J M，Wang H H，Hseu R S. Phylogeneticrelationships inGanodermainferred from the internal transcribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences［J］.Mycologia，1995，87（2）：223－238.

［4］ 苏春丽，唐传红，张劲松. 基于β－微管蛋白基因部分序列探讨灵芝属菌株的亲缘关系［J］. 菌物学报，2006，25（3）：439－445.

［5］ 唐传红，苏春丽，张劲松，等.灵芝属分类学研究进展［J］.食用菌学报，2007，14（3）：86－90.

［6］ 赵明文，陈明杰，王南，等.灵芝生产用种的亲缘关系研究［J］.南京农业大学学报，2003，26（3）：60－63.

［7］ 张传博，苏晓庆.几种基于基因组DNA 的真菌分类技术研究进展［J］. 贵州师范大学学报：自然科学版，2006（1）：113－118.

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