两种中国南海海绵的化学成分和生物活性研究

贾 睿，郭跃伟 ，黄才国

1上海海洋大学水产与生命学院，上海201306;2 中国科学院上海药物研究所新药研究国家重点实验室，上海201203;3第二军医大学，上海200433

石海绵 (Petrosia sp.)属于多孔动物门(Spongia)寻常海绵纲(Demospongiae)简骨海绵目(Haplosclerida)矶海绵科(Renieridae)石海绵属(Petrosia)动物。该属海绵种类多样，分布广泛，且含有丰富的结构新颖的次生代谢产物。文献报道石海绵(Petrosia sp.)属的特征代谢产物是长链多烯多炔类化合物，还有少量的萜类和甾体［1］。含有氰基和异硫氰的没药烷型倍半萜多发现于海绵Theonella cf.swinhoei 和Halichondria sp.中，还未见从海绵Petrosia sp.中分离得到该类倍半萜的报道，且氰基和异硫氰及甲酰胺型多相伴而生，这暗示它们在生源上有密切的关系。由于样品量的限制(粗提物287mg)，也可能是采集地和季节的差异，我们并没有发现该属特征的代谢产物-长链多烯多炔类化合物，但是我们从中首次分离得到四个倍半萜类化合物(1～4)和1 个芳香化合物(5)。

蜂海绵 (Haliclona sp.)属于多孔动物门(Spongia)寻常海绵纲(Demospongiae)简骨海绵目(Haplosclerida)蜂海绵科(Renieridae)蜂海绵属(Haliclona)动物。该属海绵含有丰富的代谢产物，也是被研究较多的一个属。蜂海绵属(Haliclona)典型的代谢产物是生物碱和甾体，还有少量的萜类和脂类［2］。我们从中分离得到两个异喹啉型生物碱(6 和7)、4 个甾体(8～11)、2 个苷类(12 和13)、1 个三萜(14)及1 个芳香化合物(5)。其中化合物6 能有效抑制黄嘌呤氧化酶。

图1 化合物1～14 的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-14

1 仪器与材料

Bruker DRX-400 核磁共振仪，1H NMR 位移值以氘代溶剂中残存的CHCl3(δ7.26 ppm)为内标，13C NMR 位移值以CDCl3(δ77.0 ppm)为内标;Q-TOF Micro LC-MS-MS 质谱仪(测定ESIMS);Finnigan-MAT-95 质谱仪 (测定EI-MS);Sephadex LH-20(Amersham Pharmacia Biotech 生产);柱层析硅胶(青岛海洋化工分厂);TLC 预制板(烟台汇友硅胶开发有限公司);石油醚(杭州炼油厂);正己烷(上海试剂一厂);丙酮(上海溶剂厂)。

实验样品于2003 年1 月采自我国南海三亚海域水下20 m 处，立即冷冻备用。种属由中国科学院海洋研究所李锦和研究员鉴定为石海绵(Petrosia sp.)和蜂海绵(Haliclona sp.);样品标本(LS-59和LS-77)保存在中国科学院上海药物研究所海洋天然产物研究实验室。

2 提取与分离

石海绵(Petrosia sp.，干重14 g)切碎后用丙酮超声提取3 次，将提取液减压浓缩除去有机溶剂，浓缩物悬浮于30 mL 水中，用等体积的乙醚及正丁醇分别萃取4 次，有机相萃取液经减压浓缩分别得到乙醚粗浸膏113 mg 及正丁醇粗浸膏63 mg。正丁醇粗浸膏经硅胶薄层层析检测未发现感兴趣的点，故舍弃。乙醚粗浸膏经硅胶(200～300 目)柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱(丙酮0～100%)，然后经SephadexLH-20 凝胶柱层析，以石油醚/氯仿/甲醇(2∶1∶1)洗脱，然后经硅胶(400～600 目)柱反复柱层析，分别得到5 个化合物:1 (3.2 mg)，2 (2.7 mg)，3 (4.1 mg)，4 (5.3 mg)和5 (6.6 mg)。

蜂海绵(Haliclona sp.，干重103 g)切碎后用丙酮超声提取3 次，将提取液减压浓缩除去有机溶剂，浓缩物悬浮于200 mL 水中，用等体积的乙醚及正丁醇分别萃取4 次，有机相萃取液经减压浓缩分别得到乙醚粗浸膏2.6 g 及正丁醇粗浸膏1.8 g。乙醚粗浸膏经硅胶(200～300 目)柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱(丙酮0～100%)，然后经SephadexLH-20 凝胶柱层析，以石油醚/氯仿/甲醇(2∶1∶1)洗脱，然后经硅胶(400～600 目)柱反复柱层析，分别得到7 个化合物:6 (23. 6 mg)，7 (4. 7 mg)，8 (136.1 mg)，9 (12.3 mg)，10 (10.7 mg)，11(19.2 mg)，14 (10.8 mg)。正丁醇粗浸膏经凝胶柱层析和正相硅胶柱层析纯化，得到2 个化合物:12(11.4 mg)，13 (9.6 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 无色油状物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 6.20 (1H，ddd，J = 15，10.8，1 Hz，H-9)，5.79 (1H，d，J = 10.8 Hz，H-8)，5.58 (1H，dd，J= 15，6.8 Hz，H-10)，2.33 (1H，m，H-11)，1.7(3H，br s，CH3-14)，1.42 (3H，t，J = 2 Hz，CH3-13)，0.99 (6H，d，J = 6.8 Hz，CH3-12，15);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 26.3 (C-1，5)，38.1 (C-2，4)，56.6 (C-3)，44.6 (C-6)，138.4 (C-7)，123.7(C-8)，123.3 (C-9)，140.5 (C-10)，31.5 (C-11)，22.4 (C-12，15)，15.1 (C-14)，152.2 (C-16);ESIMS (m/z):231［M］+。以上波谱数据与文献［3］对照基本一致，故鉴定化合物1 为3-isocyanotheonellin。

化合物2 无色油状物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ1.00 (6H，d，J = 6.6 Hz，CH3-12，15)，1.41(3H，s，CH3-13)，1.71 (3H，d，J = 1 Hz，CH3-14)，2.34 (1H，m，H-11)，5.56 (1H，dd，J = 15，6.6 Hz，H-10)，5.78 (1H，br d，J = 11 Hz，H-8)，6.21 (1H，ddq，J = 15，11，1 Hz，H-9);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 15.2 (C-14)，38.1 (C-2，4)，56.6 (C-3)，44.6 (C-6)，138.7 (C-7)，123.9 (C-8)，123.4 (C-9)，140.6(C-10)，31.4 (C-11)，22.5 (C-12，15);ESI-MS (m/z):263［M］+。以上波谱数据与文献［4］对照基本一致，故鉴定化合物2 为theonellin isothiocyanate。

化合物3 无色油状物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 1.00 (6H，d，J = 6.6 Hz，CH3-12，15)，1.42(3H，s，CH3-13)，1.72 (3H，s，CH3-14)，2.35(1H，m，H-11)，5.56 (1H，dd，J = 16，6.5 Hz，H-10)，5.79 (1H，br d，J = 11 Hz，H-8)，6.21 (1H，dd，J = 15，11 Hz，H-9);13C NMR (CDCl3，400 MHz):δ 140.7 (d)，139.2 (s)，123.7 (d)，123.4(d)，55.1 (s)，45.6 (d)，35.9 (t)，31.4 (t);ESIMS (m/z):222 ［M + H］+。以上波谱数据与文献［4］对照基本一致，故鉴定化合物3 为theonellin amine。

化合物4 无色油状物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 1.00 (6H，d，J = 6.6 Hz，CH3-12，15)，1.35，1.42 (each 1/2H，s，H-13)，1.73 (3H，br s，CH3-14)，2.34 (1H，m，H-11)，5.59 (1H，dd，J =15，6.6 Hz，H-10)，5.81 (1H，br d，J = 11 Hz，H-8)，6.22 (1H，dd，J = 15，11 Hz，H-9)，8.04 (1/2H，d，J = 2.1 Hz，H-CHO)，8.31 (1/2H，d，J =12.3 Hz，H-CHO);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 14.9 (C-14)，22.1，24.3 (each 1/2 C，C-13)，22.4(C-12，15)，27.2 (C-1，5)，31.2 (C-11)，36.7，39.0(each 1/2 C，C-2，4)，46.0，46.2 (each 1/2 C，C-3)，123.2 (C-8)，123.4 (C-9)，139.1，139.6 (each 1/2 C，C-7)，139.8，140.1 (each 1/2 C，C-10)，160.4，162.8 (each 1/2 C，C-CHO);EI-MS (m/z):249(M+)。以上波谱数据与文献［4］对照基本一致，故鉴定化合物4 为theonellin formamide。

化合物5 无色油状物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ7.7 (2H，ddd，J = 7.9，3.6，0.6 Hz，H-3，H-6)，7.5 (2H，m，H-4，H-5)，4.06 (4H，dd，J =6.6，0.6 Hz，H2-8，H2-8')，2.01 (2H，m，H-9，H-9')，0.96 (12H，dd，J = 6.8，0.7 Hz，CH3-10，CH3-11，CH3-10'，CH3-11')。以上波谱数据与文献［5］对照基本一致，故鉴定化合物5 为邻苯二甲酸二异丁酯。

化合物6 黄色粉末，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 8.94 (1H，d，J = 4.95 Hz，H-3)，7.92(1H，d，J = 7.92 Hz，H-4)，4.84 (1H，t，J = 4.81 Hz，H-OH)，5.19 (2H，d，J = 4.80 Hz，CH2-9)，4.15 (3H，s，OCH3-7)，2.10 (3H，s，CH3-6);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 160.3 (C-1)，152.8 (C-3)，118.2 (C-4)，139.1 (C-4a)，184.5 (C-5)，121.7 (C-6)，158.2 (C-7)，181.6 (C-8)，130.7 (C-8a)，64.1 (C-9)，9.1 (C-CH3)，61.4 (C-OCH3);EI-MS (m/z):233 (M+)。以上波谱数据与文献［6］对照基本一致，故鉴定化合物6 为renierol。

化合物7 黄色粉末，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 8.26 (1H，s，H-1)，7.11 (1H，s，H-4)，4.17(3H，s，OCH3-7)，2.07 (3H，s，CH3-6)，3.67 (3H，s，CH3-2);13C NMR (CDCl3，100 MHz):δ 142.0 (C-1)，162.8 (C-3)，116.7 (C-4)，138.9 (C-4a)，183.5 (C-5)，133.1 (C-6)，159.5 (C-7)，177.3 (C-8)，111.3 (C-8a)，38.4 (C-9)，9.5 (C-CH3)，61.3(C-OCH3);EI-MS (m/z):233 (M+)。以上波谱数据与文献［7］对照基本一致，故鉴定化合物7 为isoquinolinequinones mimosamycin。

化合物8 白色针晶，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 5.33 (1H，t，J =2.5 Hz)，3.50 (1H，m)，0.98 (3H，s，CH3-19)，0.90～0.78 (9H，m)，0.66(3H，s，CH3-18);EI-MS (m/z):386 (M+)，368，353，301，275，273，255，231，213，159。以上波谱数据与文献［8］对照基本一致，故鉴定化合物8 为胆甾醇。

化合物9 白色固体，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ5.54 (1H，d，J = 3.9 Hz，H-6)，5.36 (1H，d，J = 3.9 Hz，H-7)，5.18 (2H，m，H-22，H-23)，3.61 (1H，m，H-3)，1.03 (3H，d，J = 6.6 Hz )，0.94 (3H，s)，0.91 (3H，d，J = 6.8 Hz)，0.84(3H，d，J = 6.8 Hz)，0.82 (3H，d，J = 6.6 Hz)，0.62 (3H，s);EI-MS (m/z):396 (M+)，363，271，253，211。以上波谱数据与文献［9］对照基本一致，故鉴定化合物9 为麦角甾醇。

化合物10 白色固体，1H NMR (C5D5N，400 MHz):δ 5.76 (1H，br s)，5.25 (1H，m)，5.15 (1H，m)，4.82 (1H，m)，4.36 (1H，br d)，1.58 (3H，s)，0.68 (3H，s)，0.84 (3H，d，J = 6.8 Hz)，0.82(3H，d，J = 6.6 Hz)，0.62 (3H，s)。以上波谱数据与文献［10］对照基本一致，故鉴定化合物10 为(24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5β，6β-triol。

化合物11 无色针晶，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 6.50 (1H，d，J = 8.5 Hz，H-7)，6.24 (1H，d，J = 8.5 Hz，H-6)，5.18 (2H，m，H-22，H-23)，3.97 (1H，m，H-3)，1.00 (3H，d，J = 6.6 Hz，CH3-21 )，0.91 (3H，d，J = 6.8 Hz，CH3-28)，0.88 (3H，s，CH3-19)，0.83 (3H，d，J = 6.8 Hz，CH3-27)，0.82 (3H，d，J = 6.6 Hz，CH3-26)，0.82 (3H，s，CH3-18);EI-MS (m/z):428 (M+)，410，397，396，303。以上波谱数据与文献［11］对照基本一致，故鉴定化合物11 为5α，8α-epidioxycholest-6-en-3β-ol。

化合物12 白色固体，1H NMR (C5D5N，400 MHz):δ 7.70 (1H，s)，7.0 (1H，t)，5.02 (2H，m)，4.44 (1H，q)，4.24-4.10 (2H，m)，2.72 (2H，m)，1.84 (3H，s);ESI-MS (m/z):243［M+H］+。以上波谱数据与文献［12］对照基本一致，故鉴定化合物12 为胸苷。

化合物13 白色固体，1H NMR (C5D5N，400 MHz):δ 8.38 (1H，d，J = 8.1 Hz)，6.96 (1H，t，J= 6.6 Hz)，5.90 (1H，d，J = 8.1 Hz)，4.97 (1H，m)，4.42 (1H，m)，4.15 (2H，m)，2.60 (2H，m)，1.84 (3H，s);ESI-MS (m/z):229［M+H］+。以上波谱数据与文献［12］对照基本一致，故鉴定化合物13 为胞苷。

化合物14 无色油状物，1H NMR (CDCl3，400 MHz):δ 5.18 (6H，m，H-3，7，11，14，18，22)，2.15(20H，m，CH2-4，5，8，9，12，13，16，17，20，21)，1.69(6H，s，2 ×CH3)，1.60 (18H，s，6 ×CH3);13C NMR(CDCl3，100 MHz):δ 135.0 (C-10，15)，134.8 (C-6，19)，131.1 (C-2，23)，124.4 (C-3，22)，124.3(C-7，18)，39.7 (C-5，9，20，16)，28.2 (C-12，13)，26.7 (C-4，21)，26.6 (C-8，17)，25.6 (C-1，24)，17.6(2 CH3)，15.9 (4 CH3);EI-MS (m/z):410［M+］。以上波谱数据与文献［13］对照基本一致，故鉴定化合物14 为鲨烯。

4 生物活性测试

在对这些化合物进行广泛的活性筛选后，发现化合物renierol (6)对黄嘌呤氧化酶有明显的抑制作用，采用尿酸生成法［14］和超氧离子致NBT 显色法［15］测定其对黄嘌呤氧化酶的抑制活性，IC50分别为1.85 μg/mL 和1.36 μg/mL，显示其对黄嘌呤氧化酶有明显的抑制作用。

表1 Renierol (6)对次黄嘌呤造成的小鼠高尿酸血症模型的影响Table 1 Effect of renierol (6)on hypoxanthine-induced animal models of hyperuricemia

此外，还做了renierol (6)对次黄嘌呤造成的小鼠高尿酸血症模型的影响实验［16］。结果如表1 所示，在实验条件下，renierol 组小鼠血清尿酸水平与正常值相比有不同程度的升高，但与生理盐水相比，有显著降低(P ＜0.01)，说明它能部分抑制由次黄嘌呤引起的血清尿酸水平的升高。

人体内次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下生成黄嘌呤，黄嘌呤再在黄嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸，同时也生成一分子超氧离子，由于人体缺乏尿酸氧化酶，因此尿酸是嘌呤代谢的终产物，最后通过肾脏排出体外，血中尿酸长期偏高就会造成痛风。黄嘌呤氧化酶是尿酸生成的关键酶，可以作为降尿酸药物的靶点。黄嘌呤氧化酶的活性可以通过其产物的生成量来测定，本实验通过分别测定尿酸和超氧离子的生成，观察renierol 体外对黄嘌呤氧化酶活性的影响，两者的结果一致，证明renierol 是黄嘌呤氧化酶的抑制剂。为了证明其在体内是否也具有降尿酸作用，采用尿酸生成的前体物质(次黄嘌呤)造成小鼠高尿酸血症，试验结果证明renierol 在体内也有明显的降尿酸作用，其作用稍弱于别嘌呤醇，但由于它是天然产物，毒性作用小，很有希望开发成防治痛风的新药。

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