HPLC 法测定不同产地鱼腥草中不同部位芦丁的含量

李瑞玲 ，崔运启，刘奇森

黄淮学院化学化工系，驻马店463000

鱼腥草为三白草棵蕺菜属植物的全草，具有清热解毒、利尿消肿、止血等功效［1］，传统中医上主要应用于肿痛吐脓、痰热喘咳、热痢热淋、痈肿疮毒等症的治疗［2］。现代药理研究表明:鱼腥草有抗病、抗菌、解热、抗炎镇痛、升白细胞等作用［3］。鱼腥草含有多种有效成分，如槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、阿福豆苷、瑞诺苷、金丝桃苷、芦丁等黄酮类化合物［4］。芦丁及其衍生物具有广泛的药理活性，临床上主要用于防治脑出血、高血压、视网膜出血、紫癜和急性出血性肾炎［5］。虽然有文献对鱼腥草中槲皮素［1］、绿原酸［6］等含量进行报道，但对鱼腥草中芦丁的含量分析，报道的比较少，据我们的现有文献，仅见一篇文献报道了鱼腥草中芦丁的含量［7］。对全国不同区域的鱼腥草中芦丁含量的分析比较未见报道。

本文主要对不同产地鱼腥草的不同部位中芦丁的含量进行分析，通过对芦丁色谱条件的选择及优化，建立测定鱼腥草中芦丁含量测定的方法，并通过此方法，对全国不同产地鱼腥草不同部位的芦丁含量进行分析，探讨鱼腥草不同产地和不同部位芦丁的含量变化关系，以期为更好地利用和开发鱼腥草提供理论和实验依据。

1 仪器与试剂

Agilent 1200 高效液相色谱仪;CARY100 紫外-可见分光光度计;KQ3200B 超声波清洗仪(余姚市亚星仪器有限公司);DJ-120A 电子天平(福州闵衡电子仪器有限公司)。

鱼腥草药材购于驻马店同仁堂药店，经河南省天方药业有限公司王世兵博士鉴定。芦丁标准品购于源叶生物科技有限公司(生产批号:20120226)。磷酸与甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流动相(A:0.1%磷酸水溶液，B:甲醇);柱温:20 ℃;进样量20 μL;流速:1.0 mL/min;检测波长:358 nm。为了获取较好的分离效果，经查阅相关文献［8，11，12］我们设计如下三种梯度洗脱方案见表1。分别对提取液进行分离测定，比较其效果:

表1 梯度洗脱条件Table 1 Different gradient elution programmes

根据三种不同洗脱条件的方案分离鱼腥草提取液所得到的HPLC 图可知，在第I 种方案和第II 种方案的洗脱条件下所得的HPLC 图谱分离度不高，尤其是第二种方案。而在第III 种方案的洗脱条件下所得的图谱分离度高，芦丁与前后两个峰的分离度分别为R1=2.63，R2=2.15，适合于表征鱼腥草中芦丁的含量。所以本实验采用第III 种方案的洗脱条件。

2.2 对照品溶液的制备

将20 mg 芦丁标准品用体积浓度为70%的甲醇溶液定容至10 mL，然后分别配成7 个不同质量浓度的标准品对照溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取一定量的鱼腥草茎(或叶)粉碎，过40 目筛，然后按1∶10 的料液比将5.000 g 鱼腥草粉末加入50 mL 60%的甲醇溶液，于60 ℃超声提取45 min，离心、过滤，得到生药供试品溶液。所有供试品溶液经0.45 μm 微孔滤膜过滤，供HPLC 测定。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系

用甲醇溶液依次精确配制浓度为0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的芦丁标准溶液，分别注入液相色谱仪，记录芦丁色谱峰的峰面积。以峰面积y 对浓度(mg/mL)进行回归分析。得回归方程为:

Y=28596X+18.102，R=0.9999

芦丁在0. 02～0. 50 mg/mL 之间线性关系良好。

2.4.2 精密度

取鱼腥草同一供试品溶液，按上述HPLC 条件，一日内连续测定3 次，计算峰面积值的相对标准偏差RSD 为0.94%。连续三日同一时间对供试品进行测量，计算峰面积值的相对标准偏差RSD 为2.75%。结果表明方法的精密度良好。

2.4.3 重现性

等量称取一定质量的鱼腥草粉末，平行做三组实验，计算峰面积值的相对标准偏差RSD 为1.57%。结果表明重现性良好。

2.4.4 回收率

取5.000 g 鱼腥草粉末加入2.0 mg 标准品，按2.3 节方法制备待测液，测定回收率，芦丁的加标回收率为92.0%(n=3)。

2.5 样品测定

按照“2.3”项下的方法对不同产地及不同部位的鱼腥草粉末进行处理，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算芦丁的含量。结果如下:

表2 样品含量测定结果Table 2 Determination of samples

3 讨论

鱼腥草中所含化合物种类繁多，分离难度大，流动相的选择是关键。本文通过不同方案的分离结果对比与理论计算得到一种分离度较好的梯度洗脱色谱条件。从实验也可以看出色谱峰分离良好。

本论文首次在全国领域内，即中国的北部、中部和南部，对不同产地的鱼腥草中芦丁的含量进行测定对比，为鱼腥草的开发提供依据。

从测定结果看，3 个不同产地鱼腥草中芦丁的含量差异较大，其中，产自贵州的芦丁含量最高，而产自河南南阳的含量最低。在部位的比较中，鱼腥草叶中芦丁的含量普遍高于茎中的含量，大概是5到10 倍。该测定结果为鱼腥草的高效利用提供理论依据。

该实验方法操作快速、简便、灵敏度高、重现性好，可使用于中草药中芦丁含量的测定。

1 Yang ZN(杨占南)，Luo SQ(罗世琼)，Peng QC(彭全材)，et al.Determination of chlorogenic acid in different fractions of Houttuy cordata Thunb. collected in various areas in Guizhou by high performance liquid chromatography. Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药)，2010，21:1075-1077.

2 Chinese Phamacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:Chemical Industry Press，2010.

3 Mei SH(梅生华)，Liu XY(刘新泳).Progress in the studies of Houttuy cordata Thunb.Mod Enter Edu(现代企业教育)，2010(2):15-16.

4 Hu FL(胡凤莲)，Ni XL(倪细炉)，Liu WZ(刘文哲).Content variety of total flavone and quercetin in Houttuy cordata Thunb..Shanxi Normal Univ(陕西师范大学学报)，2007(S2):91-94.

5 Xia WM(夏维木)，Chen Q(陈杞)，Chen SM(陈士明)，et al.Application ESR technique for the observation of rutin on O2Removal Effect.Acade J Second Mil Med Univ(第二军医大学学报)，1997，18:388-389.

6 Luo SQ(罗世琼)，Peng QC(彭全材)，Liu DD(柳丹丹)，et al.Determination of quercetin dihydrate in different parts of Houttuynia cordata Thunb by high performance liquid chromatography.J Jiangxi Normal Ubniv，Nat Sci (江西师范大学学报，自科版)，2008，26:96-99.

7 Peng QC(彭全材)，Yang ZN(杨占南)，Hu JW(胡继伟)，et al.Determination of contents of seven flavonoids in Houttuynia Cordata Thunb by HPLC.J Jiangxi Normal Univ，Nat Sci (江西师范大学学报，自科版)，2008，32:645-648.