孕期酒精暴露对子代小鼠视皮质N-SMase／Cer的影响

高 林 冯爱芹 崔占军 陈文静 邓锦波△

1）河南大学淮河临床学院 开封 475001 2）河南大学淮河医院检验科 开封 475001 3）河南大学神经生物研究所 开封 475004

神经酰胺作为重要的第二信使，日益受到人们的重视。大量的体内、体外实验研究证明，神经酰胺可以通过十余种下游分子诱导细胞凋亡［1］。外界各种应激因子（如紫外线、微波辐射）可以改变细胞膜上鞘磷脂／神经酰胺的代谢产生生理病理过程，其机制涉及：（1）神经酰胺信号通路诱导的细胞凋亡。（2）通过改变脂筏结构或稳定性影响脂筏内蛋白的聚集，最终影响信号通路的减弱或加强，引起细胞凋亡和增殖等生物学效应。由此可见，鞘磷脂／神经酰胺的代谢很是重要。在体内，神经酰胺的生成途径主要有三种：（1）从头合成途径。（2）鞘磷脂循环途径。（3）补救合成途径。这三条合成途径并不是彼此孤立的，而是相互联系的，尤其是前两条途径。与前两条途径密切相关的代谢酶类主要有：丝氨酸-软脂酰转移酶（serine palmitoyl transferase，SPT）、鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS1and SMS2）和中性鞘磷脂酶（sphingomyelinase，N-SMase）。

酒精作为一个小的有机化合物，具有脂溶性和水溶性，没有特殊的蛋白结合能力，以自由扩散的方式很容易透过生物膜。在国外，酒精暴露研究更为关注对神经系统的影响［2］。总的来说酒精的神经毒性主要表现为细胞凋亡，其机制涉及氧化应激（oxidative pressure）、干扰神经递质传导（conduction of neurotransmitter）、干扰Bcl-2家族活性（activation of Bcl-2family）、阻碍神经营养因子（neurotrophic factors）作用等［3］。有研究证明，酒精暴露后可增加丝氨酸-软脂酰转移酶（SPT）活性，使得细胞内神经酰胺水平增加。鉴于此，本课题认为酒精暴露后中性鞘磷脂酶（N-SMase）和神经酰胺的变化趋势有着密切关系。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组 本实验所用动物为C57BL／6J小鼠（由河南省实验动物中心提供），以孕期酒精暴露模型的建立参照以往的方法［4］，实验动物随机分为3组：（1）高剂量组（high EtoH group）：每日25%酒精胃饲4.0g／kg。（2）低剂量组（moderate EtoH group）：每日25%酒精胃饲2.0g／kg。（3）对照组（control group）：每日蒸馏水胃饲4.0g／kg。在本实验中，选取E17、P0、P7和P14四个时间点的仔鼠进行观察和数据收集，对照组与酒精模型组每个时间点分别取10只仔鼠作为研究对象。为了保证数据的可靠性和统计学分析的准确性，我们依据小鼠脑图谱，把观察的对象设定为视皮质，具体部位为：在胚胎期，我们重点观察皮质板，出生后选定为V-VI层的神经细胞。

1.2 仪器 激光扫描共聚焦显微成像系统（Olympus，FV1000，日本），振荡切片机（LR59590，美国），荧光显微镜（Olympus，BX61日本），N，N-亚甲双丙烯酰胺、丙烯酰胺购于Fluka公司（美国）；预染蛋白Marker购于Fermentas公司（美国）。

1.3 方法

1.3.1 免疫细胞荧光染色定性定量分析神经酰胺：本研究利用抗神经酰胺荧光抗体标记神经细胞的Cer。震荡切片，PBS洗三遍。0.2%Triton X-100通透10min，PBS洗三遍。与二抗相同宿主的血清封闭30min，PBS洗三遍。一抗4度湿盒内孵育过夜（一抗：兔抗神经酰胺单克隆抗体，1：100，Sigma-Aldrich（Saint Louis，MO）），PBS洗三遍。加荧光二抗（二抗：驴抗兔IgG Alexa Fluor 488.1：500），室温孵育2h（避光）。甘油封片，激光共聚焦显微镜下进行观察拍照（Alexa Fluor 488激发波长约为494nm）。利用olympus-FV-1000图像分析软件计算每个视野下完整的单个细胞荧光值。

1.3.2 N-SMase活性测定：用1×的缓冲液将样品蛋白浓度稀释至250μg／mL，按100μL／孔加至96孔反应板，然后加入100μL反应液，37℃进行反应45min，利用Spectramax M2酶标仪，激发波长为544nm检测OD562吸光度值。酶活性的吸光值＝各浓度组吸光值减去空白孔吸光值。

2 结果

2.1 孕期酒精暴露对子鼠大脑皮质神经细胞神经酰胺含量的影响 Cer作为重要的第二信使，其变化趋势将决定细胞的最终命运。利用Cer免疫抗体检测细胞内Cer水平，有利于我们了解孕期酒精暴露对子鼠大脑皮质神经细胞的影响。本实验结果表明实验组大脑皮质神经细胞内的Cer比对照组明显增加，而且具有剂量依赖性。结果见表1。

2.2 孕期酒精暴露对子鼠大脑皮质神经细胞N-SMase酶活性的影响 酒精的毒性机制十分复杂。酒精暴露导致神经细胞凋亡的机制涉及氧化应激、干扰神经递质传导、干扰Bcl-2家族活性、阻碍神经营养因子以及SM／Cer途径等。N-SMase作为鞘磷脂向神经酰胺转化过程中的关键酶，其酶活性的变化决定细胞内Cer的水平。本研究结果表明，孕期酒精暴露导致子代小鼠大脑皮层神经细胞SMase酶活性明显增加。在E17时，二者均高于对照组；P0时，达到最高峰，P7和P14时，逐步下降。具有波动性。结果见表2。

表1 孕期酒精暴露对各组子鼠大脑皮质细胞神经酰胺表达影响 （±s，n＝10）

表1 孕期酒精暴露对各组子鼠大脑皮质细胞神经酰胺表达影响 （±s，n＝10）

注：低剂量组与对照组相比，＊P＜0.05；高剂量组与对照组相比，＊＊P＜0.05

组别 荧光强度／细胞（×1000）E17 P0 P7 P14对照组0.87±0.10 0.90±0.11 0.91±0.14 1.89±0.09低剂量组（酒精2g／kg） 1.02±0.08＊ 1.14±0.09＊ 1.08±0.13＊ 1.15±0.12＊高剂量组（酒精4g／kg） 1.51±0.09＊＊ 1.68±0.12＊＊ 1.57±0.14＊＊ 1.61±0.08＊＊F 值15.67 24.15 21.68 19.34

表2 孕期酒精暴露对各组子鼠大脑皮质细胞N-SMase酶活性的影响 （±s，n＝10）

表2 孕期酒精暴露对各组子鼠大脑皮质细胞N-SMase酶活性的影响 （±s，n＝10）

注：低剂量组与对照组相比，＊P＜0.05；高剂量组与对照组相比，＊＊P＜0.05

组别 OD562光度值E17 P0 P7 P14对照组1078±102 1147±105 1026±95 1054±89低剂量组（酒精2g／kg） 1527±137＊ 1851±117＊ 1624±124＊ 1225±112＊高剂量组（酒精4g／kg） 1877±148＊＊ 2108±213＊＊ 1754±104＊＊ 1472±121＊＊F 值15.47 19.34 21.84 19.24

3 讨论

Cer作为第二信使，调控细胞凋亡（包括自噬）、增殖、分化，诱导细胞迁移，参与应激、免疫、炎症等多种生理、病理功能［5］。Cer作为SM的代谢产物，在诱导细胞凋亡过程中起着关键作用［6］。在体、内外酒精暴露实验中，用丝氨酸棕榈酰转移酶（serine palmitoyltransferase.SPT，Cer从头合成途径的限速酶）抑制剂（多球壳菌素myriocin）抑制Cer从头合成途径，神经元胞内Cer水平和凋亡率明显下降［7］；用SMase抑制剂（desipramine）抑制SMase，细胞内Cer水平和凋亡率也明显降低［8］。由此可见，酒精暴露诱导的细胞凋亡伴随着Cer的增加。本实验结果表明孕期酒精暴露后子代小鼠大脑皮质神经细胞的Cer水平明显高于对照组。综合以上资料，本实验认为孕期酒精暴露后子代小鼠大脑皮质神经细胞内聚集的Cer或直接通过CAPP（ceramide-activated Ser-Thr phosphatase）、PKC（protein kinase C）途径诱导细胞凋亡，或间接经Cer酶代谢为鞘胺醇通过PKH（Protein Kinase B homologue）、YPK（yeast protein kinase）诱导细胞凋亡［9］。

SMase主要有5种同工酶，能催化SM水解，生成Cer和胆碱［10］，其中N-SMase和A-SMase与细胞凋亡关系密切。N-SMase主要位于细胞膜的内侧，主要参与SM和Cer相互转换的SM循环；为此，我们测定了孕期酒精暴露后子代小鼠大脑皮质内N-SMase酶活性，结果显示在孕期酒精暴露后子代小鼠的E17、P0、P7和P14，N-SMase的酶活性较各自的对照组都明显增加。由此可见，孕期酒精暴露后子代小鼠大脑皮质神经细胞内N-SMase酶活性的增加与Cer的增加具有同步性。这与其他文献报道相一致。

虽然影响Cer生成和聚集的因素多而复杂，但是对鞘磷脂、鞘磷脂酶和神经酰胺的研究不仅仅是对酒精毒理机制的探索，也对提供预防缺血后神经细胞的凋亡和退行性神经疾病具有重要意义。

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