牙周组织发育期上皮剩余的组织学观察

于西佼 唐开亮 杜毅

上皮剩余是成熟牙周膜中唯一的上皮结构，上皮剩余的在牙周组织修复再生、内环境稳定等方面的可能作用已得更多研究人员的重视[1]，但目前对上皮剩余的研究仍比较匮乏，本文观察牙周组织发育期的上皮剩余细胞形态分布，研究该期上皮剩余细胞的增殖、凋亡及OPN和BSP的表达。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 原位细胞凋亡试剂盒（Roche German）；OPN和BSP多克隆抗体由Larry W.Fisher博士（National Institute of Dental and Craniofacial Research，Maryland，USA）馈赠；PCNA和Bcl-2单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂（北京中杉）；Tris/HCI（Sigma USA），蛋白酶K（MERK German）；OLYMPUS显微镜及照相系统（JAPAN）。

1.2 标本制备 取出生后第15、19和25天的BALB/c小鼠12只（山东大学动物实验中心），引颈处死，解剖分离含下颌第一磨牙区下颌骨，新鲜配置4%多聚甲醛固定、10%EDTA脱钙2个月，近远中向5 μm连续切片。HE染色观察牙周组织的发育和上皮剩余的分布和细胞形态。

1.3 免疫组化 采用SP免疫组化法对PCNA、Bcl-2、OPN和BSP表达进行免疫组织定位。常规石蜡切片水化至水，3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗，正常山羊血清室温孵育20 min，倾去血清，滴加的PCNA、Bcl-2、OPN和BSP抗体（均1:100稀释），37 ℃温箱孵育2 h。PBS冲洗，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，孵育15 min后滴加辣根酶标记链霉卵白素，滴加DAB液镜下显色，苏木素复染3 min，常规脱水、透明封片。

1.4 细胞凋亡检测采用原位末端标记（TdT-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL）法，石蜡切片常规脱蜡水化至水，按照细胞凋亡原位检测试剂盒说明书操作，常规脱水封片，镜下观察照相。以PBS液代替TUNEL反应液作阴性对照。凋亡细胞阳性表达位于细胞核，为覆盖整个细胞核的棕黄色或褐色着色。

2 结果

2.1 HE染色 上皮剩余细胞靠近牙骨质表面呈簇状分布，主要分布于牙颈部和根分叉，簇内细胞数量不等，排列无规则，相互重叠，部分细胞界限不清，胞核不规则呈较强的嗜苏木精染色（图1）。

2.2 TUNEL检测细胞凋亡 小鼠出生后第19天，牙槽骨形成活跃，可见较多新生成骨细胞，牙周膜主纤维斜形埋入颌骨内。TUNEL结果显示，牙周膜中可见较均匀分布的凋亡阳性表达的成纤维细胞（图2）部分成骨细胞呈凋亡阳性表达，可见观察到凋亡小体存在。牙根根分叉处的牙周膜牙骨质侧可见较多的ERM，部分呈TUNEL阳性表达（图3）。

2.3 免疫组化 牙周膜牙骨质侧的上皮剩余细胞呈PCNA阴性或弱阳性表达（图4），大量成纤维细胞呈PCNA阳性表达；上皮剩余细胞呈Bcl-2阴性表达，牙周膜牙槽骨侧Bcl-2阳性表达强于牙周膜牙骨质侧（图5）。OPN的免疫组化结果示，牙骨质与牙周膜界面可见较强的棕黄着色，上皮剩余细胞呈阳性表达（图6）。未见ERM细胞阳性表达BSP。

图1 上皮剩余呈团块状，与周围成纤维细胞分界较明显。（HE×20）(AL牙槽骨,D牙本质,OB成骨细胞,PDL牙周膜)

图2 调亡阳性表达细胞（箭头）和细胞凋亡小体（*示）（TUNEL×40）

图3 上皮剩余细胞呈凋亡阳性表达（TUNEL×40）

图4 上皮剩余细胞呈PCNA阴性表达，牙周膜中散在阳性表达的细胞（SP×40）

图5 上皮剩余呈Bcl-2阴性表达。牙周膜牙槽骨侧Bcl-2阳性表达强于牙周膜牙骨质侧（SP×20）

图6 上皮剩余细胞阳性表达OPN（SP×20）

3 讨论

上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath）的诱导功能结束后，发生断裂，部分上皮细胞离开根面，迁入牙周膜，形成上皮剩余。牙周发育期牙槽骨改建活跃、牙周膜主纤维走向调整，上皮根鞘断裂后最终形成上皮剩余，所以上皮根鞘断裂后所经历的更新或塑形形成上皮剩余也是牙周组织正常发育的一部分。本研究结果表明，牙周组织发育过程中，上皮剩余细胞与牙周组织中的成骨细胞和成纤维细胞一样都可观察到细胞凋亡。成熟的牙周组织中的上皮剩余细胞在受到炎症等信号刺激后呈现增殖活性，可参与牙源性囊肿的发生[2]。牙周组织发育期上皮剩余细胞可发生细胞凋亡，但我们研究结果未发现此时上皮剩余细胞出现明显的增殖活性，提示其可能缺乏相关刺激因素，从而为表现明显增殖活性。有研究证实，伴随牙齿萌出，建合期在咬合力作用下上皮剩余表现出明显增殖的活性[3]。

细胞培养证实上皮剩余细胞可分泌前列腺素（prostaglandins）和骨吸收因子（bone resorbing factor），从而认为上皮剩余可能有抑制骨性结合，维持牙周膜间隙的作用[4]。Hasegawa等[5]发现在牙骨质修复中，上皮剩余细胞表现PCNA活性，其可能参与牙骨质的修复。OPN和BSP都是骨矿化相关因子，在骨质的形成和矿化中发挥重要作用，这些骨矿化相关蛋白可能在牙骨质的形成中发挥一定作用，有研究已证实OPN在牙骨质的形成发挥重要作用[6]。本研究结果证实，牙周发育期的上皮剩余细胞也表达OPN，与他们的实验结果相一致。上皮剩余并不是完全无用的剩余结构，在某些特定时期或刺激因素下可表现出积极的生物学性状，从而发挥某些生物学功能，不过其机制有待深入研究。

[1] Haku K，Muramatsu T，Hara A，et al.Epithelial cell rests of Malassez modulate cell proliferation，differentiation and apoptosis via gap junctional communication under mechanical stretching in vitro[J].Bull Tokyo Dent Coll，2011，52（4）：173-182.

[2] Talic N F，Evans C A，Daniel J C，et al.Proliferation of epithelial rests of Malassez during experimental tooth movement[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop，2003，123（5）：527-533.

[3] 于西佼.上皮根鞘和上皮剩余在牙齿发育过程中的生物学性状和作用研究[D].山东大学，2007.

[4] Rincon J C，Xiao Y，Young W G，et al.Production of osteopontin by cultured porcine epithelial cell rests of Malassez[J].J Periodontal Res，2005，40（5）：417-426.

[5] Hasegawa N，Kawaguchi H，Ogawa T，et al.Immunohistochemical characteristics of epithelial cell rests of Malassez during cementum repair[J].J Periodont Res，2003，38（1）：51-56.

[6] Yamamoto T，Domon T，Takahashi S，et al.Determination of two different types of cellular cementogenesis in rat molars:a histological and immunohistochemical study[J].Matrix Biol，2005，24（4）：295-305.