肉桂抑制人宫颈癌细胞生长增殖的体外研究*

余涌珠 何冬梅 李江滨 欧嘉文 郑若洋 陈婉嫦 蔡梦珊 林锦琼

肉桂是樟科植物，树皮芳香，可做香料，肉桂的桂皮含有挥发油，油中主要成分为桂皮醛、少量乙酸桂皮酯，桂皮酸和肉桂醇D1、D2等。肉桂药用价值最早载于《神农本草药》，有温经通脉，健脾燥胃，消肿利湿，发汗解肌之功能[1]，但关于其抗肿瘤研究少且不够深入。宫颈癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤之一，发病率居第二位[2]，传统的放化疗治疗方法副作用大，目前的研究表明中医药在肿瘤防治中前景广阔，中药治疗癌症有高效低毒的优点。本次实验通过体外实验观察肉桂对人宫颈癌Hela细胞生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌Hela细胞株，由广东医学院衰老研究所提供。Synergy2多功能酶标仪（Biotek），FACSCanto2流式细胞仪（美国BD公司），CO2培养箱（RSBiotech），OLYMPUS XD-101倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司），超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）。

1.2 细胞培养 用10%小牛血清DMEM培养基培养Hela细胞，置于5% CO2，37 ℃培养箱中培养。

1.3 药物配制 取0.5 g肉桂单味中药颗粒（广东一方制药有限公司）加5 ml超纯水，高压灭菌制得浓度为100 mg/ml肉桂水煎液；氟尿嘧啶（5-FU，25 mg/ml，天津金耀氨基酸有限公司）注射液用除菌无血清培养基稀释为2.5 mg/ml，备用。

1.4 方法

1.4.1 CCK-8法测定细胞生长抑制率

1.4.1.1 肉桂抑制肿瘤细胞增殖的量效作用 采用96孔板，设高中低3个剂量肉桂组、5-FU组、对照组，每组3个平行孔，每孔加入100μl细胞悬液（含5×103个细胞），待细胞贴壁完全后，加入5μl药液，高中低3个剂量肉桂组终浓度分别为5.0 mg/ml、1.0 mg/ml、0.2 mg/ml的肉桂水煎液，5-FU组终浓度为0.1 mg/ml的5-FU，对照组加等体积培养液。5% CO2，37 ℃孵育48 h后，按照CCK-8试剂盒说明书操作，酶标仪测吸光值。

1.4.1.2 肉桂抑制肿瘤细胞增殖的时效作用 采用96孔板，设对照组和肉桂组，每组3个平行孔，每孔加入100 μl细胞悬液（含5×103个细胞），待细胞贴壁完全后，加入5 μl药液，肉桂组终浓度为5.0 mg/ml肉桂水煎液，对照组加等体积培养液。5% CO2，37 ℃孵育分别12、24、48、72 h后，按照CCK-8试剂盒说明书操作，酶标仪测吸光值。

1.4.2 贴壁率实验 采用48孔板，设对照组和肉桂组（终浓度为5.0 mg/ml肉桂水煎液），每组3个平行孔，每孔加入200 μl细胞悬液（含1×104个细胞），孵育4 h贴壁后，吸去培养液用 PBS洗2遍后，每孔加入200 μl 培养液和20 μl的CCK-8混合液，37 ℃ 5% CO2孵育1 h后，用酶标仪测每孔的吸光值。

1.4.3 对细胞迁移能力的影响 采用划痕实验，实验分组同上，按参考文献[3]进行。

1.4.4 FCM测细胞周期 实验分组同上，采用PI染色法，将PI染色的单细胞悬浮液用流式细胞仪测试10 000个细胞，进行细胞计量术分析，用Wincycle 32软件进行数据分析。

1.5 统计学处理 实验数据用SPSS 17.0处理，计量资料以（±s）表示，采用t检验。计数资料采取字2检验，实验图像采用Image pro plus 6.0分析处理，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8法测定细胞生长抑制率 肉桂对肿瘤有明显抑制作用且随着药物浓度的增加而增强。作用48 h后，0.2、1.0、5.0 mg/ml肉桂水煎液的抑制率分别为15.40%、24.58%、97.12%，5-FU组为68.41%。5.0 mg/ml肉桂水煎液作用12 h的细胞增殖抑制率为57.46%，24 h为88.52%，48 h为95.32%，72 h为95.81%。

2.2 贴壁率结果 Hela细胞对照组的贴壁率为100%，肉桂组的贴壁率为48.3%（P<0.05）。

2.3 对细胞迁移能力的影响 细胞划痕实验结果见表1。与对照组相比，肉桂组的Hela细胞划痕间隙恢复缓慢，说明肿瘤细胞迁移能力显著下降（P<0.05）。

表1 对Hela细胞划痕间隙的影响（±s） μm

表1 对Hela细胞划痕间隙的影响（±s） μm

*与对照组比较，P<0.05

组别0 h12 h24 h36 h48 h对照组472.14±28.75363.30±23.17229.57±25.81120.33±17.0060.18±11.18肉桂组478.04±30.19*456.88±23.12*415.49±19.6*391.73±22.22*364.50±20.6*

2.4 FCM检测细胞周期 对照组相比，肉桂组G1期比例略降低，S期比例明显降低，G2期明显增多。表明肉桂使宫颈癌细胞主要阻滞在G2期，见表2。

表2 肿瘤细胞周期变化 %

3 讨论

肉桂含有多种有效成分，以往实验已证实肉桂中的桂皮醛对人多种肿瘤细胞具有杀伤作用，肉桂酸对人肺腺癌细胞有诱导分化作用，邻羟基肉桂酸锗对小鼠宫颈癌有抑制作用，肉桂提取物可通过调节CD8+T细胞抑制肿瘤的生长[4-6]。

本实验结果表明肉桂能显著抑制宫颈癌细胞增殖，且该抑制作用具有量效和时效作用，并能显著抑制宫颈癌细胞的贴壁，降低细胞迁移能力。细胞周期结果显示肉桂组S期比例明显降低，G2期明显增多，说明肉桂可能通过抑制染色体复制，将宫颈癌细胞阻滞在G2期。

[1] 韦如萍，黄永芳，胡德活，等.肉桂的研究现状及发展趋势[J].经济林研究，2006，24（3）：65-70.

[2] Andrawiss M.Cervical cancer vaccines available in 2005[J].Drug Discov Today，2005，10（14）：949-950.

[3] 黄敏丽，罗国客，陈维平，等.Tumstatin肽对条件培养基下视网膜脉络血管内皮细胞迁移的影响[J].实验研究，2008，26（6）：448-450.

[4] 梁秋霞.肉桂有效成分提取及其生物活性研究[D].广西大学，2010.

[5] 叶连宝，欧小敏，涂洁琼，等.邻羟基肉桂酸锗对小鼠U14宫颈癌的抑制作用[J].西北药学杂志，2010，25（6）：438-439.

[6] Kwon H K，Jeon W K，Hwang J S，et a1.Cinnamon extract suppresses tumor progression by modulating angiogenesis and the effector function of CD8+T cells[J].Cancer Letters，2009，278（2）：174-182.