2型糖尿病伴牙周炎牙周膜干细胞成牙骨质分化能力的研究

刘尔黎，钟雯怡，刘增一，杨 琨，刘 琪

(遵义医科大学附属口腔医院，贵州 遵义 563099)

2型糖尿病与多种疾病有密切关系，牙周炎现已被普遍认为是2型糖尿病的并发症之一，已被学者确认为糖尿病的第六大并发症[1]。牙周炎是牙齿周围组织的慢性炎症，而目前研究许多的关注点都在于牙龈的退缩、牙槽骨的吸收以及牙齿的松动脱落[2]。但是患者可存在牙齿冷热刺激敏感的症状，很大程度上取决于牙根面的牙骨质破坏以及再生修复能力的降低。2型糖尿病作为全身因素可促进牙周炎的发展，通常其严重程度与血糖水平呈正相关关系[3]，并且牙周炎的治疗有利于糖尿病患者血糖值以及糖化血红蛋白的控制，而治疗糖尿病也有利于牙周炎各项指标的恢复[4]，因此，对糖尿病伴牙周炎造成的更为严重的牙周炎症状机理的研究，有利于此类患者疾病病理状态的合理解释、治疗以及预后效果的评估。

牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)来源于牙根周围的韧带组织牙周膜，因其具有分化成为成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞的能力，在牙周组织再生中可能扮演重要角色[5]，自Seo等[6]成功把牙周膜干细胞从牙周膜中分离出来，对其相关研究目前仍在不断深入，Gay 等[7]体外实验结果表明，PDLSCs具有较强的克隆形成能力。

目前有学者研究表明，来源于牙周膜的间充质干细胞可以诱导分化为成牙骨质细胞[5,8-9]，成牙骨质细胞是牙骨质形成的重要功能细胞，在牙根形成、牙骨质修复中起着关键性作用。我们的研究团队前期研究结果显示，2型糖尿病伴牙周炎的牙周膜干细胞骨向分化能力降低[10]，但PDLSCs的成牙骨质分化能力是否发生改变目前还不甚清楚。为此，本研究拟对2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞的成牙骨质分化能力进行探索，为解释2型糖尿病伴牙周炎状态下，牙周组织再生修复能力降低，牙骨质破坏所导致的牙本质暴露，患者冷热刺激敏感的可能原因提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂 胎牛血清FBS(四季青公司)；胰蛋白酶、α-MEM培养基、胶原酶、(Gibco 公司)；鼠抗人 CD29、CD44、CD45、stro-1、CD90、CD271、CD166单克隆抗体(Abcam公司)；CCK-8(日本Dojindo Kagaku 公司)；BD流式细胞仪、湿度CO2细胞培养箱、超净工作台、体式显微镜、倒置相差显微镜、荧光显微镜、细胞总RNA提取试剂盒(生工生物公司)；cNCPs英国伯明翰大学的Smith教授提供，Real Time-PCR仪、凝胶成像分析仪、分光光度计、PCR逆转录仪、Western blot相关试剂、ALP定量试剂盒(南京建成)。

1.2 方法

1.2.1 取材标准及实验分组 健康组(H-PDLSCs)牙周膜组织获取主要对象为在遵义医科大学附属口腔医院就诊，18～25岁需拔出前磨牙或第三磨牙患者(因正畸或智齿异位萌出)。入选患者的标准为不吸烟，无糖尿病病史及家族史，血糖水平正常、口内余留牙不少于20颗；无系统疾病或感染。2型糖尿病伴牙周炎组(DP-PDLSCs):就诊于遵义医科大学附属医院的2型糖尿病伴重度牙周炎症病患，平均年龄为30～45岁入选标准:患者被诊断为2型糖尿病，病程为1年及以上，未有其他严重全身疾病及并发症;用药量近期未见明显变化，无吸烟史。并符合以下条件:①口内残留牙数不少于15颗，因重度牙周炎需拔除的患牙，无明显龋坏、牙髓及根尖周病;②X线片上牙槽骨的损失情况超过根长1/2者，半年内应无牙周病治疗史。组织块与单克隆分离培养法：收集到的牙周膜组织PBS缓冲液冲洗3次，收集冲洗液，800 rpm离心3 mim，1%Ⅰ型胶原酶消化，培养基中和离心，组织均匀平铺于10 cm细胞培养皿，加入预配制浓度为100 mL/L胎牛血清的DMEM-F12培养液约4～5 mL全覆盖碎屑组织，置于37 ℃含5%CO2的恒温箱中贴壁培养观察到4 h后见细胞贴壁形态，继续培养20 h换液，于细胞汇聚率为90%～100%时进行常规消化传代，稀释为1/200 μL的PDLSCs细胞，接种于96孔板，24 h换液，待单克隆细胞长满孔板底部后消化传代即为第3代PDLSCs。

1.2.2 流式细胞仪检测相关表面分子 取生长状态良好的第3代PDLSCs，常规消化离心后，稀释并计数，细胞数量为5×105个/1.5 mL EP管，加入已配制好的含3%胎牛血清PBS重悬细胞，加入CD45、CD90、CD44、CD29、CD166 2 μL，4 ℃冰箱避光孵育12 h(过夜)，12 000 r/min 离心5 min，加入单抗相对应的荧光二抗避光孵育2 h，无需荧光的加入等量PBS。加入含3%胎牛血清的PBS混合均匀溶液，吹匀，3% 胎牛血清PBS清洗，12 000 r/min离心5 min，清洗2～3次后加300 μL 3%胎牛血清 PBS，重悬，流式细胞仪检测各组细胞表面分子。实验重复次数3次。

1.2.3 细胞增殖能力检测 利用CCK-8试剂盒对比两组细胞7 d增殖能力，利用第3代生长增殖状态良好的H-PDLSCs及DP-PDLSCs两组细胞，EDTA+胰蛋白酶消化离心，均匀稀释并上机细胞计数，细胞密度为1×103/孔接种至96孔板，分别在每日正午12时测7 d增殖曲线，每孔细胞培养基加入预配制200 μL 10%胎牛血清 DMEM-F12。各组细胞加入10 μL CCK-8，置于37 ℃含5%CO2的恒温箱4 h，上酶标仪检测450 nm吸光度值，绘制7d H-PDLSCs及DP-PDLSCs连续生长曲线。实验重复次数3次。

1.2.4 RT-PCR检测 ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP mRNA表达取培养至规定时间状态良好的两组细胞，用10 μg/mL cNCPs[11]和矿化诱导培养基(成牙骨质培养基)处理，培养7 d。各组细胞RT-PCR检测相关基因。本实验重复次数3次。按TRIzol说明书方法提取EMSCs总RNA，并用反转录试剂盒合成cDNA。参照GenBank数据库，基因号分别为：ALP(ID:249)、OPN(ID:6696)、OCN(ID:43567)、CEMP1(ID:752014)、CAP(ID:36084)，以Primer primer 5.0计算机软件设计引物；以GAPDH为内参照，采用Real Time-PCR检测，反应体系为：premix 10 μL、dye 0.4 μL、ddH2O 6.6 μL、上下游引物各0.5 μL、样本模板2 μL；反应条件:95 ℃ 5 min、 94℃ 30 s 、65℃ 30 s、 40个循环。实验重复3次，所用引物均由上海生工公司合成，各引物基因序列见表1。

1.2.5 Western blot检测蛋白GAPDH、OCN、CEMP1、CAP的表达 取14d后牙周膜干细胞用10 μg/mL cNCPs成牙骨质诱导[11]和矿化诱导培养基处理后H-PDLSCs及DP-PDLSCs两组细胞进行总蛋白提取，BCA法进行蛋白定量测定，电泳，转膜，封闭，免疫反应，以GAPDH内参蛋白对相关蛋白OCN、CEMP1、CAP进行显影检测蛋白表达。本实验重复次数3次。

表1 引物基因序列

1.2.6 ALP活性和矿化结节形成量分析 常规消化处理增殖良好的两组细胞，10 μg/mL cNCPs成牙骨质诱导培养14d后，取两组细胞分别用ALP试剂盒(AKP/ALP)对各组细胞进行染色。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测 PDLSCs 表面标志物 本实验通过组织块法与单克隆法成功分离并培养扩增出健康来源牙周膜干细胞与2型糖尿病伴牙周炎来源的牙周膜干细胞，流式细胞仪检测PDLSCs 表面标志物 CD45、CD90、CD44、CD29、CD166其检出率分别为0.02%、99.94%、99.59%、100.00%、99.99%，证明本细胞提取方法获得的细胞都为间充质来源(见图1)。

图1 流式细胞仪检测PDLSCs 各表面标志物的检出率

2.2 CCK-8检测两组细胞增殖 在连续7 d相同条件培养情况下，CCK-8检测两组细胞增殖情况，H-PDLSCs增殖能力高于DP-PDLSCs，两组用独立样本T检验检测差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2 CCK-8检测两组细胞增殖情况比较

2.3 RT-PCR检测DP-PDLSCs中各组基因表达量比较 两组细胞成牙骨质诱导7 d后RT-PCR结果表明DP-PDLSCs ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP mRNA的表达量，DP-PDLSCs中各组基因表达量较H-PDLSCs低(见图3)。

*：与DP-PDLSCs比较，P<0.05。图3 RT-PCR检测DP-PDLSCs中各组基因表达量

2.4 Western blot检测各组蛋白的表达 成牙骨质诱导14 d后OCN、CEMP1和CAP蛋白表达，OCN、CEMP1、CAP蛋白表达量DP-HPDLSCs较H-PDLSCs低(见图4)。

图4 Western blot检测各组蛋白的表达

2.5 ALP活性和矿化结节形成量分析 常规消化处理增殖良好的两组细胞，成牙骨质诱导培养14 d后，H-PDLSCs成牙骨质矿化能力高于DP-PDLSCs成牙骨质矿化能力。

A:H-PDLSCs;B:DP-PDLSCs。图5 ALP分析两组细胞的活性和矿化结节形成量

3 讨论

目前，已经有很多研究证实，慢性牙周炎作为2型糖尿病的第六大并发症[11]，并且糖尿病患者牙周炎患病的风险是健康者的2～3倍[12]，严重的影响到中老年患者的生活质量。因此，对糖尿病及牙周炎相互影响的发生、发展过程仍是牙周医学研究的热门话题。

PDLSCs作为牙周组织再生的重要细胞之一，在牙周组织内的核心作用主要是是通过干细胞克隆增殖以及分化来形成不同数量以及不同种类的牙周组织。本实验我们选取了CD45、CD90、CD44、CD29、CD166细胞表面标记物进行检测，其结果显示牙周膜干细胞具备间充质来源的特点，并且存在良好的干细胞干性以及优良的增殖能力。值得一提的是，本实验结果发现，2型糖尿病伴牙周炎患者牙周组织来源的牙周膜干细胞的增殖及分化能力降低。而牙周膜干细胞是一种独特的间充质干细胞，能够分化为多种牙周组织包括：牙周膜、牙骨质、牙槽骨等。牙骨质是特殊的无血管矿化组织，类似骨样组织，牙骨质基质由成牙骨质细胞分泌而形成，是牙周组织再生的关键[13]。 并且最近相关研究发现，牙周膜干细胞能够分化成为成牙骨质细胞[5,8-9]，成牙骨质细胞是牙周组织中牙骨质形成的重要功能细胞，在牙根形成、牙周病牙骨质修复及牙根吸收与修复过程中起着关键性作用。牙根表面修复性牙骨质的形成，成牙骨质细胞附着的干预，最终起到防止牙根吸收的目的。成牙骨质细胞分泌的牙骨质基质矿化起着决定作用，所以成牙骨质细胞是牙骨质修复和再生的基础。成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞均可由牙周膜干细胞分化而成，生成牙骨质基质的唯一组织细胞是成牙骨质细胞，其与牙槽骨内的成骨细胞来源于同一前体细胞，位于牙周膜内侧[14]。因此，2型糖尿病伴牙周炎患者牙周组织来源的牙周膜干细胞的增殖及分化能力降低进一步表明了此类疾病患者牙周组织再生能力的减弱，病态细胞的各种能力降低也是由于糖尿病及牙周炎两种疾病状态的叠加所导致。

牙骨质附着蛋白(Cementum attachment protein，CAP)表达于牙骨质与成牙骨质细胞中[15]，牙槽骨中未见阳性反应[16]，CAP被认为可以作为成牙骨质细胞特异性标志分子。因此本实验选定CAP蛋白作为检验成牙骨质方向分化的指标之一。碱性磷酸酶(ALP) 是有骨化潜能的细胞标志性酶之一，它在细胞体外钙化起关键作用。骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是间充质干细胞重要的矿化相关基因之一，在上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath，HERS)的发育中就已经存在，并且在牙骨质矿化过程中调节晶核的生长和矿化速度[17]。骨钙素(Osteocalcin，OCN )是反映成骨细胞分化成熟的指标，能准确反映成骨细胞的成骨功能，研究表明牙根面靠近牙周膜区域的牙骨质内有高浓度的OCN表达[18]，能够作为细胞矿化的关键因子促进牙骨质再生。牙骨质蛋白1(Cementum protein 1,CEMP1)是一种新的牙骨质成分，其存在仅限于成牙骨质细胞及其祖细胞-牙周膜干细胞中也高度表达，牙周膜干细胞CEMP1的过表达增强了成牙骨质分化和牙周及成骨细胞表型的减弱，表明CEMP1紧密参与了牙骨质的再生及形成[19]。

本实验以ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP为指标对2型糖尿病伴牙周炎来源的人牙周膜干细胞成牙骨质矿化功能的变化对比。通过RT-PCR结果表明DP-PDLSCs： ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP mRNA的表达量均低于H-PDLSCs；Western blot检测结果趋势与RT-PCR结果相一致，成牙骨质诱导14d OCN、CEMP1、CAP蛋白表达量DP-HPDLSCs较低。ALP试剂盒染色结果显示，DP-PDLSCs成牙骨质矿化能力也减弱，由此，可推测疾病状态下牙周组织遭到影响与破坏，进一步影响了牙周膜干细胞增殖及分化为成牙骨质细胞的能力，导致牙周组织再生修复受到障碍。

牙周炎是以牙周软硬组织的破坏和改建为主要表现的发病率较高的疾病，严重影响口腔健康，并且可能影响糖尿病等其它系统性疾病。在牙周组织破坏中起着重要作用的炎性细胞因子是白细胞介素-1β(Interleukin，IL- 1β)和肿瘤坏死因子- α(Tumor necrosis factor alpha，TNF- α)[20-21]。这些炎性细胞因子在牙周的炎症病变部位和组织破坏期间显著升高[20]。此外，在牙周治疗和组织恢复到健康状态后，这些细胞因子显著降低[21]。

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由于胰岛素分泌缺陷或其生物学功能受损而引起的糖、脂肪、蛋白质、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，其典型特征为高血糖。2型糖尿病主要表现为胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)，即胰岛 β细胞能够产生足够浓度的胰岛素，但机体组织细胞对正常浓度的胰岛素反应不足，需要更高浓度的胰岛素才能发挥正常的生物学效应。研究表明，感染导致胰岛素抵抗状态，细菌内毒素对胰岛素敏感性有显著影响[22]。已经证明，IL-1β通过凋亡机制促进蛋白激酶C的激活，导致胰腺β细胞的破坏[23]。此外，IL-1β通过耗尽细胞储能和产生一氧化氮，对β细胞具有细胞毒作用。在动物模型和人体研究中，TNF-α已被认为是胰岛素抵抗和2型糖尿病的病因[24-25]。TNF-α的升高水平会改变细胞内胰岛素的信号传导(抑制胰岛素受体的酪氨酸激酶活性)并减少其合成。胰岛素反应性葡萄糖转运蛋白，产生类似于2型糖尿病的胰岛素抵抗的胰岛素抵抗综合征[25-26]。

综上所述，2型糖尿病伴牙周炎疾病状态下，牙周膜干细胞的向成牙骨质细胞分化能力降低，并且细胞的矿化水平也降低，牙周组织再生修复能力较差，出现此类情况可能源于高血糖状态、以及牙周毒力因子和局部微环境因素的影响，但牙周炎以及全身疾病状态的糖尿病如何协同影响牙周组织再生修复内在分子机制的探索仍是研究学者们应该进一步关注的方向。