马兜铃和蜜马兜铃毒性研究*

★ 杨标 施敏 李正红 杨武亮 陈海芳 严志宏 袁金斌＊ 罗小泉 (.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 南昌330004;.江西中医学院基础医学院 南昌330004)

马兜铃为传统常用中药，系马兜铃植物北马兜铃(Aristolochia contorta Bge.)和马兜铃(Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果实，味苦，微辛寒，归肺、大肠经。主要功能有清肺降气，止咳平喘，清肠消痔，用于肺热喘咳，痰中带血，肠热痔血，痔疮肿痛［1］。

近年来，关于马兜铃酸引起肾损害的报道较多，称之为马兜铃酸肾病(Aristolochic acid nephrosis，AAN)［2－5］。已有多种含马兜铃酸的中药因此被禁用。马兜铃中马兜铃酸的含量也较高，其毒性应该引起重视，但目前尚无关于马兜铃急性毒性的研究报道。炮制是中药“去毒存效”的重要手段，我们的前期研究［6，7］表明，马兜铃经蜜炙后其毒性成分有明显的降低。本实验对马兜铃及其蜜炙品进行半数致死量的测定，并以确定用药剂量的可靠性，并探讨蜜炙减毒的可能性。

1 试验仪器与材料

1.1 试验材料 动物:昆明种小鼠(体重17 －23g)，雌雄各半，由江西中医学院工程中心提供，生产许可证号:SYXK (赣)2011 －0001。

材料:东北马兜铃购自安徽海鑫中药饮片有限公司(亳州，安徽)，经江西中医学院杨武亮教授鉴定为北马兜铃(Aristolochia contorta Bge.)的成熟果实;炼蜜为市售。

1.2 仪器设备 电子称(HZY －6000 －C，福州华志科学仪器有限公司);电煎密闭煎药机(YJ13B－G YJ20B－G，北京东华原医疗设备有限责任公司)。

2 试验方法

2.1 药物制备

2.1.1 药材的准备 取马兜铃，拣去果柄、除去杂质、筛去灰屑。于烘箱烘干(60℃，2 小时)后备用。

2.1.2 蜜炙［6－7］取马兜铃生品1.0 kg，用300 g炼蜜(加少量开水稀释)拌匀，稍闷，待蜜液吸尽，用文火炒至不粘手，颜色加深，有蜜和药物相混合的气味溢出时取出放凉，装至密封袋封口(每100 g 药材用炼蜜30 g)。

2.1.3 药材提取液制备 取马兜铃生品1.0 kg，加12 倍量水煎煮提取2 小时，滤出提取液，残渣加8倍量水继续提取2 小时，合并两次滤液，浓缩至1 g(生药)/mL 的浸膏(比较粘稠，浓度较大)，蜜马兜铃同法提取浓缩至1 g(生药)/mL，置冰箱4℃保存备用，使用前分别配制成所需浓度。

2.2 急性毒性实验［8］

2.2.1 预实验 取小鼠20 只，以4 只为一组(雌雄各半)，分成5 组，选择剂量间距较大的一系列剂量，分别给各组小鼠以马兜铃水提液灌胃，观察出现的症状并记录死亡数，找出引起0 －100%死亡率剂量的所在范围，观察得到马兜铃Dmin=20.2 g/kg·天，Dmax=84.0 g/kg·天;蜜马兜铃Dmin=41.0g/kg·天，Dmax=100.0g/kg·天。

2.2.2 正式试验 在预试验所获得的0%和100%致死量的范围内，按等比级数增减，选用5 个剂量(马兜铃剂量组:84.0 g/kg·天、58.8 g/kg·天、41.2g/kg·天、28.8g/kg·天、20.2 g/kg·天，相邻剂量之间比例为1∶0.7;蜜马兜铃剂量组:100.0 g/kg·天、80.0g/kg·天、64.0 g/kg·天、51.2g/kg·天、41.0 g/kg·天，相邻剂量之比为1∶0.8)，各剂量组动物数为10 只(雌雄各半)，分别用苦味酸标记。动物根据体重随机分配，完成动物分组和剂量计算后按组灌胃给药。给药后观察30 分钟内小鼠活动改变情况和死亡数，按相应公示计算LD50。

2.2.3 统计学处理 试验完毕后，统计各组小鼠死亡数目，计算死亡率p，按孙氏改良寇氏公式计算LD50、LD50的标准误、LD50 的95%平均可信限，回归方程LD50= lg－1［χm – i * (ΣP – 0.5)］(χm为最大剂量的对数;i 为相邻2 组高剂量与低剂量之比的对数;P 为各组死亡率;Σp 为各组动物死亡率的总和);LD50的标准误Sx50 =i* ［(ΣP – ΣP2 )/(n – 1)］1/2(n 为每组动物数);LD50的95%可信限= lg －1(X50 ±1.96* Sx50 )，(其中X50 =χm– i * (ΣP – 0.5));LD50的平均可信限= LD50±(LD5095%可信限的高限–低限)/2。

3 结果

3.1 小鼠中毒反应 灌胃后30 分钟内，各剂量组小鼠自主活动明显减少，呼吸先急促，后加深并趋于平缓，眼睑下垂闭合，偶有惊厥现象，有反转反射。随着灌胃持续，各剂量组小鼠毛色暗淡粗糙，小鼠死亡前有腹式呼吸，俯卧和抽搐现象，反转发射消失。

3.2 小鼠死亡率 记录7 天内小鼠的死亡数和死亡时间，计算死亡率，结果见表1、2。

用寇式改良法计算，得到马兜铃的LD50=34.0g/kg·天;95%可信限为42.0 －27.7 g/kg·天;LD50的平均可信限为(34.1 ± 7.2)g/kg·天(P=0.95)。蜜马兜铃的LD50=62.6g/kg·天;95%可信限为(55.1 －71.1)g/kg·天;LD50的平均可信限为(62.6 ± 8.0 )g/kg·天(P=0.95)。

表1 马兜铃各剂量组灌胃小鼠死亡率

表2 蜜马兜铃各剂量组灌胃小鼠死亡率

4 讨论

马兜铃生品苦寒味劣，易致恶呕，研究发现蜜炙后能缓和药性，增强润肺止咳功效，且可矫味，避免呕吐，有“蜜炙甘缓而润肺”之说［9］。中药马兜铃中主要毒性成分为马兜铃酸类物质，我们的前期研究发现［7］，马兜铃经蜜炙后马兜铃酸类物质含量显著降低，且有新的物质生成，或者毒性成分在炮制后发生了化学反应，使其结构发生改变，致使其所引起的毒性作用降低或未表现出来。

本次实验结果显示，蜜马兜铃较马兜铃半数致死量大，约为其1.84 倍，前者约为人临床用药剂量的417 倍，后者约为人临床用药剂量的227 倍，表明马兜铃蜜炙后毒性显著降低。综上，马兜铃经蜜炙后临床用药更为安全，马兜铃宜蜜炙。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］. 北京:中国医药科技出版社，2010:48 －49.

［2］梅全喜，高玉桥，胡世林. 应理性对待含马兜铃酸类中药［J］. 中国药房，2006，17(7):554.

［3］Jinbin Yuan，Lihua Nie，Xubiao Luo，et al. Simultaneous determination of nine aristolochic acid analogues in medicinal plants and preparations by high－performance liquid chromatogr － aphy［J］. Talanta，2007，73:644.

［4］Jinbin Yuan，Qian Liu，Guobing Wei，et al. Characterization and determination of six aristolochic acids and three aristololactams in medicinal plants and their preparations by high － performance liquid chromatography － photodiode array detection － mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass spectrometry，2007，21:2 332.

［5］Jinbin Yuan，Qian Liu，Weifeng Zhu，et al. Simultaneous analysis of six aristolochic acids and five aristololatams in herbal plants and their preparations by high－performance liquid chromatography diode array detection fluorescence detection［J］. Journal of Chromatography A，2008，1182:85.

［6］龚千锋，刘高胜，张的凤，等. 马兜铃炮制前后化学成分的研究［J］.江西中医学院学报，2008，20(1):68.

［7］杨标，李正红，杨武亮，等.不同炮制方法对马兜铃中马兜铃酸类物质含量的影响［J］.时珍国医国药，2012，(10):2 553 －2 555.

［8］陈奇.中药药理实验方法学［M］. 第2 版. 北京:人民卫生出社，2006:236 －237.

［9］董立莎，尚明英，蔡少青.马兜铃品种－产地考证及炮制历史沿革的研究［J］.中国中药杂志，2003，28(10):927.