★ 赖佐发 廖宝源 钟国庆 (江西省赣州市食品药品检验所 赣州341000)
胃得康胶囊是以行气止痛,用于气滞所致的胃病为主治病症的复方胶囊制剂,由延胡索(醋制)、佛手、鸡骨香、白及、枯矾、石菖蒲等中药组方。为有效控制该制剂的内在质量,笔者应用薄层色谱(TLC)法建立了佛手、延胡索(醋制)、石菖蒲的鉴别方法,采用高效液相色谱(HPLC)法对延胡索中主要有效成分廷胡索乙素进行了含量测定,现报道如下。
Agilent 1260 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);电子天平BS110(北京赛多利斯天平公司);USC-302 型超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)。佛手对照药材(批号为120933 -200303)、延胡索对照药材(批号为120928 -201007 )、石菖蒲对照药材(批号为121098 -200904 )均购自中国药品生物制品检定所,供薄层色谱对照鉴别用;延胡索乙素对照品(批号为110726 -201112,含量为99.6% )购自中国食品药品检定研究院,供含量测定用;胃得康胶囊(批号分别为090801,090802,090803,江西保利制药有限公司);硅胶G(国药集团化学试剂有限公司);甲醇为色谱纯,水为蒸馏水,其他试剂均为分析纯。
佛手[1]167:取本品内容物4.0g,加乙醇l0mL,超声处理30 分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇10mL 使溶解,置中性氧化铝柱上,以无水乙醇40mL洗脱,收集洗脱液,减压回收溶剂至干,残渣加无水乙醇2mL 使溶解,作为供试品溶液。另取佛手对照药材0 5g,加乙醇5 mL,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005 年版一部附录VI B)试验,吸取上述两种溶液各2μL,分别点于同一硅段G 溥层板上,以环己烷一乙醇乙酯(3∶1)为展开剂,展开.取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。而阴性对照品溶液则无此斑点(图1 A)。
延胡索[1]130:取延胡索对照药材lg,加甲醇20mL,加热回流l 小时,滤过,滤液蒸干,残渣用10%醋酸20mL 使溶解,加浓氮试液调节pH 值至10 -1l,用乙醚振摇提取3 次,每次20mL.合并乙醚提取液,蒸干,残渣加甲醇lmL 使溶解,作为对照药材溶液。另取延胡索乙素对照品适量,加甲醇制成每1mL 含0.5mg 的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010 年版一部附录VI B)试验,吸取上述两种溶液各2 μL,含量测疋项下供试品溶液2μL 分别点于同一硅段G 溥层板上,以正己烷一甲醇一乙醇乙酯一浓氨试液(8∶2∶2∶0.1)为展开剂,展开.取出,晾干,置碘蒸气。熏3 分钟后取出,挥尽板上吸附的碘后,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。而阴性对照品溶液则无此斑点(图1B)。
石菖蒲[1]85:取本品内容物4g,加水50mL,加热回流30 分钟,滤过,滤液用石油醚(30 -60℃)振摇提取2 次,每次l5mL,合并石油醚液,蒸干,残渣加甲醇2mL 使溶解,作为供试品溶液。另取石菖蒲对照药材lg,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010 年版一部附录VI B)试验,吸取供试品溶液10 μL,对照药材溶液5 μL,分别点于同一硅胶G 薄层板上,以石油醚(60 -90℃)-乙酸乙酯(3∶1)为展开剂,展开. 取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相同的位置上,显相同颜色的荧光斑点。而阴性对照品溶液则无此斑点(图1C)。
图1 薄层色谱图
2.2.1 色谱条件 色谱柱:DiamonsilC18 柱(200 mm×4.6 mm,5μm);以甲醇-0.1%磷酸(三乙胺调pH = 6. 0)(62 ∶38)为流动相:检测波长为282nm;柱温:40℃;流速:1. 0 mL /分;进样量:10μL。理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3 000。
2.2.2 溶液制备 精密称取延胡索乙素对照品适量,加甲醇制成每1mL 含48ug 的溶液,即得。取本品装量差异项下的内各物,混匀,取约3g,精密称定,精密加入甲醇- 浓氨试液(20 ∶1)混合溶液50mL,称定重量,加热回流1 小时,放冷,加甲醇-浓氨试液(20∶1)混合溶液补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液25mL. 蒸干,残渣用10% 醋酸20mL 使溶解于分液漏斗中,用浓氨试液凋节pH 值至10 -11,加乙醚振摇提取4 次,每次20mL,合并乙醚提取液,蒸干,残渣加甲醇使溶解转移至5mL量瓶中.加甲醇至刻度,摇匀,即得。取缺延胡索的阴性样品约3 g,精密称定,按供试液制备方法制成阴性对照品溶液。
2.2.3 方法学考察 干扰试验:照上述色谱条件,分别取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照品溶液各10μL,分别注入色谱仪。供试品溶液色谱图中,在与对照品溶液色谱图相应位置上显示相同保留时间的色谱峰,而阴性对照品溶液在此保留时间处无干扰(见图2)。
线性关系考察:分别精密吸取延胡索乙素对照品溶液(0.096 0 g /L )1、2、5、8、10mL,置10mL 量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配成质量浓度分别为0.009 6、0.019 2、0.048 0、0.076 8、0.096 0 g/L系列对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,以峰面积积分值(Y)为纵坐标、延胡索乙素质量浓度(X)为横坐标进行线性回归,得回归方程Y=1156.6X-1.133 3,r=0.999 9。结果:延胡索乙素进样量在0.096 -0.960μg 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。
精密度试验:精密吸取延胡索乙素对照品溶液(0.048 g /L)10 μL,按上述色谱条件重复进样6次,测定延胡索乙素峰面积积分值。结果的RSD 为0.71% (n=6 ),表明精密度良好。
重现性试验:取同一批(批号为090801 )样品,依法制备供试品溶液并测定。结果平均含量为100.4ug / 粒,RSD 为0.87%(n =6 ),表明重复性良好。
稳定性试验:取同一供试品(批号为090801)溶液,分别于0,2,4,6,8,12 小时时分别进样10μL,测定延胡索乙素的峰面积。结果的RSD 为0. 48%,表明供试品溶液在12 小时内稳定。
加样回收试验:取延胡索乙素对照品约12.0mg,精密称定,置100 mL 容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取续滤液10mL 置25 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得质量浓度为0.048 g /L 的对照品溶液,备用。取已知含量的样品(批号为090801 )1.5 g,精密称定,分别加入上述延胡索乙素对照品溶液1 mL,各2 份,按供试品溶液的制备方法制备加样回收供试品溶液,分别进样10μL,测定。结果见表1。
表1 延胡索乙素加样回收试验结果(n=6 )
2.2.4 样品含量测定 取胃得康胶囊3.0 g,精密称定,按供试品溶液制备方法制备溶液并进样10 μL,测定峰面积,计算延胡索乙素的含量。结果批号为090801,090802,090803 的样品中延胡索乙素的含量分别为100.4,100.6,100.8 μg /粒。
图2 高效液相色谱图
延胡索乙素(dl - tet rahy dro palmat ine,dl -THP)是从中药延胡索中提取的生物碱,其左旋体l-T HP 又称颅痛定,具有镇痛作用[2]。近年来发现还有降压、抗心率失常、抗血栓、钙拮抗、抑制胃酸分泌等药理作用[2]。2010 年版《中国药典(一部)》中延胡索以甲苯-丙酮(9∶2)为展开剂,为了避免使用甲苯,采用了正己烷一甲醇一乙醇乙酯一浓氨试液(8 ∶2 ∶2 ∶0. 1)为展开剂,取得很好的分离效果。[1]佛手醇提取液具有明显镇咳,平喘,祛痰作用和提高抗应激能力。[4]采用了2010 年版《中国药典(一部)》佛手的薄层鉴别方法[1],但供试品经过中性氧化铝柱,可消除延胡索的干扰,并分别与阴性对照溶液进行对照,结果没有干扰、专属性强。延胡索乙素为延胡索中的主要有效成分,并且在方中的含量较高,因此选择延胡索乙素作为胃得康胶囊含量测定的指标成分。采用了2010 年版《中国药典》(一部)延胡索含量测定项下的流动相,分离效果好,无干扰,结果准确。本试验建立的定性、定量方法,可用于胃得康胶囊的质量控制。
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