针刺神庭、百会对缺血再灌注大鼠超微结构的影响

林如辉 ，李钻芳 ，胡海霞 ，朱晓勤 ，毛敬洁 ，刘 娇 ，张 蕴 ，陈立典

（1.福建中医药大学康复医学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州350122；4.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

最近研究显示：在中国大城市脑血管病是第三位死亡原因，而在农村女性中为首位死亡原因，在男性中则为第二位［1］。缺血性脑卒中居中医四大顽证（风、痨、臌、膈）之首，为中西医重点研究的疾病之一，该病最核心的问题是神经系统损害引起的神经功能障碍，其主要表现在语言、运动、思维及情绪等方面［2-4］。有研究表明针刺督脉、阳明经等穴，能够改善脑卒中后的认知功能障碍。课题组前期实验［5］从NF-kB信号通路探讨针刺MCAO大鼠神庭、百会后蛋白的变化，结果表明经电针刺激后大鼠脑内NF-kBp65、p-IkB 表达水平下降，而 IkB、Bax、Fas水平上升，与模型组比较明显抑制了NF-kB的活性，从而起到抑制神经元凋亡的作用，证明了针刺神庭、百会可以通过NF-kB信号通路改善大鼠认知功能障碍的作用机制。本文拟在前期实验基础上观察电针MCAO大鼠神庭、百会后的脑超微结构变化情况，以进一步阐明针刺神庭、百会后改善MCAO大鼠认知功能障碍的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重（260＋20）g，由福建中医药大学实验动物中心提供［许可证号：SYXK（闽）2005—004］。适应性喂养1周后，用随机数字表法将大鼠编号。

1.2 仪器 H-7650透射电镜（日本Hitach公司）；电镜CCD相机-图像采集分析系统（德国Soft-Imaging-System公司）；UC-6超薄切片机（德国Leica公司）。

1.3 方法

1.3.1 造模 依据文献［6］，术前所有实验动物禁食12 h。大鼠称重后，以腹腔注射水合氯醛3 mL／kg麻醉。分离并暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉及其深部分支翼腭动脉。依次结扎颈总动脉近心端、颈外动脉远心端，并于颈总动脉分叉处近心端预留结扎线。用微动脉夹夹闭翼腭动脉及远端颈内动脉。距颈总动脉分叉处1.0 mm处用显微剪刀剪一切口，将备好的线栓插入颈内动脉，插入长度约18.0～22.0 mm至大脑前动脉近端，完全阻断大脑中动脉血供。缚紧预先放置于颈总动脉的结扎线，颈部伤口常规缝合。2 h后，轻柔回抽线栓至颈总动脉分叉处。术中和术后保持室温25℃左右，用白炽灯照射动物，使其肛温维持在（37±1）℃，直到恢复活动。假手术组只分离动脉，不结扎、插线。手术结束后，动物置于室温（25℃）环境下苏醒，正常饮食。

1.3.2 实验分组及干预 ①假手术组：置于普通笼中饲养，只给予同等条件抓取，不给予任何治疗；②模型组：造模后回笼饲养，只给予同等条件抓取，不给予任何治疗；③ 针刺组：参考《实验针灸学》取大鼠神庭和百会穴，应用GM101电针仪，电压峰值6V，以针体轻轻抖动为度，疏密波，频率1～20 Hz。每次30 min，每天1次，共7 d。手术后2 h开始治疗，直至第7天动物被处死。各组10只。

1.3.3 电镜制样及观察 依据文献［7］，按实验要求将大鼠麻醉，开胸，生理盐水200 mL经左心室快速冲洗，4%多聚甲醛（pH＝7.4）400 mL灌流固定。取脑后置入4%多聚甲醛内 4℃ 固定24～48 h，经3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定24 h，1%锇酸后固定 2 h，0.1 mol／L 磷酸盐缓冲液（pH7.2）充分浸洗；50%～100%酒精-丙酮梯度脱水，每次15 min；半浸透 37℃ 1.5 h，纯浸透 37℃ 3 h，包埋后在37℃、45℃、60℃分别聚合12、40、48 h。超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色。透射电镜下观察切片，先在低倍下全面观察，再详细观察细胞的外形、细胞核及细胞器。

2 结 果

2.1 针刺干预MCAO大鼠脑神经元超微结构观察见图1。电镜观察假手术组：神经元细胞大多呈长椭圆形，膜完整，表面突起较多；核大，呈圆形或椭圆形，表面核孔丰富，染色质分布均匀，异染色质无边聚；细胞内线粒体丰富，截面呈长圆形或圆形，线粒体嵴未见断裂或溶解；粗面内质网较多，表明核糖体丰富，无明显脱落或扩张；高尔基复合体偶见，糖原丰富。或见轴突，轴突内见丰富的线粒体嵴微丝微管。见丰富的树突，细胞内有丰富的突触，突触前膜及后膜内丰富小泡，突触间隙清晰（图1A）。模型组神经元呈圆形或不规则形，表面突起少、有些细胞膜破裂；细胞核大而圆，染色质分布较分散，有些细胞核内染色质部分边聚、核孔变大甚至核膜破裂；线粒体体积变大，线粒体嵴断裂或消失甚至呈空泡化；粗面内质网扩张，有些扩张成池状，脱颗粒现象严重；糖原分散，偶可见溶酶体。轴突树突变小，轴突内线粒体空泡样变，微丝微管不连续或变稀疏，突触结构分离 （图1B）。针刺组神经元细胞近圆形或近椭圆形，膜相对完整，表明有突起；细胞核圆形，染色质分布相对均匀，少见异染色质边聚；细胞内线粒体较多，体积大小不均，部分线粒体内嵴稀疏，部分断裂，偶见空泡样变；粗面内质网未见明显扩张，糖原较多。轴突少，轴突内线粒体空泡样变不明显，微丝微管可见，突触偶见（图1C）。

图13组大鼠脑神经元的超微结构图（×15000）

2.2 针刺刺激神庭、百会后脑血管超微结构观察见图2。假手术组血管基膜完整且较厚，血管内突起较多，偶见内皮细胞核及红细胞，胞饮小泡较多，内皮细胞之间的连接偶见，可见内皮细胞内线粒体，血管与周围的脑组织连接紧密，无肿胀及分离（图2A）。模型组脑内血管基膜变薄，血管内皮光滑，少见内皮细胞及内皮细胞核，血管与周围脑组织分离，空泡化变明显（图2B）。针刺组血管基膜相对较厚，内皮细胞可见，可见细胞核，血管与周围脑组织连接相对较好，无明显肿胀（图2C）。

图23组大鼠脑血管的超微结构图（×15000）

3 讨 论

应用百会、风府、人中、大椎、神庭等督脉腧穴治疗中风病，可起到开窍启闭，健脑宁神的作用。百会穴属督脉，统督诸阳，又与任脉相通，故百会能治诸阳经之疾。神庭也属督脉，为督脉、足太阳、阳明之会，神者，天部之气也，庭者，庭院也，聚散之所也。神庭可宁神醒脑、降逆平喘，对于神智方面的疾病，非神庭不能治。

针刺刺激神庭、百会穴后超微结构变化明显，假手术组神经元细胞大多正常，血管正常，无明显变化。当造模后神经元细胞水肿明显，血管与周围组织分离，细胞空泡化变明显，电子密度明显降低，在形态学上说明MCAO大鼠造模成功。大鼠大脑缺血缺氧后炎性细胞浸润，血管通透性改变，脑组织迅速进入凋亡或液化坏死样变，进而引起一系列功能障碍。本实验表明：针刺神庭、百会后神经元超微结构保持相对较完整，血管水肿程度减轻，血脑屏障渗透性减少，从而减轻脑组织的水肿。脑组织水肿减轻后，神经元、神经胶质细胞的功能得以部分恢复，所以能在一定程度上改善缺血再灌注后的认知功能障碍，这为针刺神庭、百会改善缺血再灌注后认知功能障碍的作用机制提供客观的依据。

［致谢：本实验在国家中医药管理局三级（细胞结构与功能）实验室各位老师帮助下顺利完成，在此表示真诚的谢意!］

［1］中华人民共和国卫生部.2012年中国卫生统计年鉴［M］.北京：中国协和医科大学出版社，2012：52-53.

［2］NYENHUIS D L，GORELICK P B，GEENEN E J，et al.The pattern of neuropsychological deficits in Vascular Cognitive Impairment-No Dementia （Vascular CIND）［J］.Clin Neuropsychol，2004，18（1）：41-49.

［3］LINDEBOOM J，WEINSTEIN H.Neuropsychology of cognitive ageing，minimal cognitive impairment，Alzheimer's disease，and vascular cognitive impairment［J］.Eur J Pharmacol，2004，490（1／3）：83-86.

［4］SACHDEY P S，BRODATY H，VALENZUELA M J，et al.The neuropsychological profile of vascular cognitive impairment in stroke and TIA patients［J］.Neurology，2004，62（6）：912-919.

［5］FENG X D，YANG S L，LIU J，et al.Electroacupuncture ameliorates cognitive impairment through inhibition of NF-kappa B-mediated neuronal cell apoptosis in cerebral ischemia–reper fusion injured rats［J］.Molecular Medicine Reports，2013，7（5）：1516-1522.

［6］冯晓东，刘娇，陈立典.电针对局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力的影响及其机制［J］.中国康复理论与实践，2013，19（3）：227-230.

［7］林如辉，李钻芳，曾建伟，等.山慈姑醇提取液对SGC-7901细胞的抗肿瘤机制［J］.福建中医药大学学报，2012，2（5）：22-24.