痛风宁颗粒对急性痛风性关节炎模型大鼠关节局部炎证因子及TLRs／MyD88的影响

周必洪，傅玉辉，闫 虎，陈宝军，张庆，张子怡，王艺如，苏友新

（福建中医药大学，福建 福州 350122）

课题组前期研究［1-4］发现痛风宁颗粒具有较好抗炎、消肿、镇痛等作用，能有效控制急性痛风性关节炎的症状，但其具体作用环节尚不明确。近年来研究表明：急性痛风性关节炎的发病可能与关节滑膜TLR-2、4、MyD88 mRNA的高表达、关节滑液中 TNF-α、IL-1β的增多及大量中性粒细胞进入关节腔有关。课题组拟以急性痛风性关节炎大鼠为模型，观察痛风宁颗粒对模型大鼠关节滑液TNF-α、IL-1β含量及滑膜组织中TLR-2、4，MyD88 mRNA表达的影响，以进一步阐明痛风宁颗粒抗炎、镇痛作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 36只SPF级健康雄性SD大鼠，体重（200±15）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供［实验动物许可证号：SCXK（沪）2007-0005，合格证号：0073141］，委托福建中医药大学实验动物中心购买和饲养。

1.2 主要试剂及药物 白细胞介素-1β（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（北京普尔伟业生物科技有限公司，批号：20091225、2009122）；微晶型尿酸钠（Sigma-aldrich 公司，批号：108K5309）；逆转录试剂盒、PCR Master Mix（Fermentas公司，批号：K1622、K0171）；100bp Ladder（百泰克公司，批号：PR3001）；痛风宁颗粒：每克含生药3.2 g（福州辰星药业有限公司提供，中试产品批号：101024）；秋水仙碱：0.5 mg／片（云南省玉溪望子龙生物制药有限公司，批号：20090702）。

1.3 主要设备 PYX-DHS恒温箱（上海跃进医疗器械厂）；CUT4060石蜡切片机（德国Leica公司）；BH-2光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；101A-2真空干燥箱（上海实验仪器总厂）；PE9600基因扩增仪（香港PERKIN ELMER公司）；梯度PCR仪（英国GENE TECHNOLOGIES 公司）；FJ2008PS γ 放射免疫计数器（西安二六二厂）；Allegra 64R低温高速离心机（美国Beckman Coulter公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 药品制备

1.4.1.1 尿酸钠溶液的制备 电子天平称取尿酸钠晶体2.5 g，高温高压后，加入无菌生理盐水至100 mL，制成 25 mg／mL的尿酸钠悬浊液，4℃保存，用前摇匀。

1.4.1.2 干预药物制备 成人（60 kg）每日痛风宁颗粒、秋水仙碱常用量分别为27 g、3 mg，根据人与大鼠用量关系［5］换算得出大鼠每日以上2种干预药物的用量分别为 2.93 g／kg、0.325 mg／kg。 依据上述用药量计算出每只大鼠的用药量，加入2 mL蒸馏水溶解，制成混悬液，4℃保存，用前摇匀。

1.4.2 动物分组及造模 用随机数字表法把适应性喂养1周后的36只SPF级健康雄性SD大鼠分成正常组、模型组、痛风宁颗粒组、秋水仙碱组共4组。参照Coderre造模方法［6］，固定板固定大鼠，以右膝关节为中心，常规消毒，以右膝外侧膝眼为进针点，向每个正常组大鼠关节腔内注射0.2 mL生理盐水，其余3组大鼠以同样的方法分别注入0.2 mL 2.5%尿酸钠悬浊液。

1.4.3 药物干预 造模1 h后，痛风宁颗粒组、秋水仙碱组大鼠根据体重分别使用相应药物混悬液2 mL灌胃，正常组、模型组大鼠分别以2 mL生理盐水灌胃，每日1次，连续3 d。

1.4.4 标本采集 末次灌胃1 h后，各组实验大鼠分别用10%水合氯醛以300 mg／kg的剂量腹腔注射麻醉。麻醉成功后，以大鼠右膝关节为中心，常规备皮、消毒、铺巾，戴无菌手套，切开右膝关节囊，关节腔用1 mL生理盐水冲洗，收集冲洗液，取1滴于载玻片上涂片，福尔马林溶液固定；切取关节囊，固定于4%中性甲醛固定液。

1.4.5 关节液HE染色光镜下中性粒细胞计数 将固定的载玻片进行HE染色，严格按HE染色试剂盒步骤操作，400倍光镜下取5个随机视野进行中性粒细胞计数，取均值。

1.4.6 滑膜组织HE染色光镜下观察 取出固定于4%中性甲醛液中的关节囊，冲洗后常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制作成蜡块后，切片、脱蜡、复水、HE染色，光镜下观察形态学的变化。

1.4.7 关节液细胞因子TNF-α、IL-1β检测 严格按照放射免疫试剂盒步骤操作，检测各组大鼠关节冲洗液中TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.8 滑膜组织中TLR-2、4及MyD88 mRNA的表达检测 ① 总RNA的提取：采用Trizol法提取大鼠膝关节滑膜组织细胞总RNA，严格按照试剂盒步骤操作。②RNA纯度及完整性检测：取2 μL总RNA稀释50倍后加入紫外分光光度计中，测定样品在260 nm和280 nm的吸光值，计算出OD 260／OD 280值， 按 1 OD＝40 μg／mL RNA 计算 RNA 的纯度。③cDNA的制备：在PCR管中配制反应体系，1 μg RNA的体积根据所得的OD值计算得出，用无RNA酶的水调整体系至20 μL；在PCR仪上设置反应条件，30℃ 5 min、42℃ 60 min、95℃ 5 min、70℃ 5 min，反应结束后保存于-20℃冰箱。④RT-PCR反应：引物的设计，由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成Pubmed上检索的TLR-2、4及MyD88完整外显子序列（见表1）；反应体系的配置：在RT-PCR反应专用八联管中进行，每个样本重复3个复孔，并做一个阴性对照；反应条件，94℃ 3 min、94℃ 30 s、X℃30 s（TLR255℃、TLR455℃、MyD8855℃）、72℃ 30 s、35个循环，72℃ 10 min，4℃ 保存。 在GS-1 PCR仪工作程序上设定三步法检测。

表1 引物设计

2 结 果

2.1 模型鉴定 造模前正常组、模型组、痛风宁颗粒组大鼠皮毛光泽色白，活泼好动，饮食正常；造模1 h后，除空白组外，其余3组大鼠均出现关节红肿，局部皮肤温度升高，活动减少，舔足，饮食量减少等现象。图1、表2显示除正常组外，其余各组大鼠关节液中性粒细胞数均升高，模型组较正常组有非常显著性差异（P＜0.01），表明急性痛风性关节炎模型大鼠造模成功。

2.2 关节液中性细胞HE染色光镜下计数 见图1、表 2。

图1 大鼠关节液HE光镜下染色图（×400）

表2 各组关节液中性粒细胞含量比较

2.3 大鼠膝关节滑膜组织HE染色光镜下观察见图2。图2显示：正常组滑膜组织可见极少中性粒细胞，滑膜细胞排列规则，无水肿；模型组滑膜组织可见大量中性粒细胞，滑膜细胞排列不规则，有明显水肿；痛风宁颗粒组及秋水仙碱组滑膜组织可见少量的中性粒细胞，滑膜细胞排列较规则，轻度水肿。

图2 大鼠滑膜HE染色图（×200）

2.4 关节液细胞因子TNF-α、IL-1β检测结果 见表3。

表3 各组关节液中TNF-a、IL-1β含量比较

2.5 大鼠膝关节滑膜组织中TLR-2、4及MyD88 mRNA表达检测

2.5.1 RNA纯度及完整性鉴定 经测定各组抽提的总RNA结果均满足OD260／OD280值在1.8～2.0范围及1%琼脂糖凝胶电泳中28S和18S条带清晰的要求。表明提取的总RNA纯度高、完整性好。

2.5.2 各组TLR-2、4及MyD88 mRNA相对表达水平的RT-PCR结果 见表4。

3 讨 论

Toll样受体（toll-like receptor，TLRs）中的 TLR-2、4和其重要的衔接蛋白髓样分化因子（MyD88）参与了痛风的炎症反应的发生、发展和消退过程［7-8］。静息状态下，TLRs受体与MyD88结合成复合物，未受刺激时处于无活性状态。当TLRs受体与病原相关分子结合后，受体发生二聚化，胞质中的TLR结构域与MyD88的羧基末端相互作用，MyD88就开始募集下游丝／苏氨酸蛋白激酶IRAK1和IRAK2，导致IRAK自身磷酸化；磷酸化的IRAK脱离MyD88与TRAF6（TNFR-associated factor）结合，活化的 TRAF6引起 MAP3K（mitogen-activated protein kinase）家族成员 NIK（NF-κβ-inducing kinase）活化；此后又激活 κβ 激酶（κβ kinases，IKKs），导致 κβ 的泛素化而从 κβ／NF-κβ 复合物释放；NF-κβ 由此活化转位进核，导致一系列特定基因的表达，从而产生原发性致炎因子如IL-1β、TNF-α等，完成炎症的信号转导过程［9-10］。其中与痛风关系密切的细胞因子有IL-1β、TNF-α。IL-1β能激活IL-1受体，致使其它炎症调节因子及相关趋化因子发挥作用，引起中性粒细胞进入并聚集于尿酸盐沉积部位；此又可增强IL-1与其受体结合，引起更多中性粒细胞汇聚于尿酸盐沉积部位；如此正反馈调节，促使急性痛风性关节炎的炎症产生和发展。而TNF-α能激活NF-κB信号通路，促使IL-1、IL-8等细胞因子分泌及中性粒细胞出现吞噬活性并释放氧自由基和蛋白水解酶，导致尿酸盐沉积处出现充血、水肿、大量炎症细胞浸润、纤维素渗出，并呈不断加重［11］。因此，急性痛风性关节炎发病与TLRs／MyD88信号通路的激活，细胞因子IL-1β、TNF-α等的升高及中性粒细胞的聚集等因素密切相关。

表4 各组TLR-2、4及MyD88 mRNA表达情况比较

本实验观察到：痛风宁颗粒能够显著降低大鼠病变关节关节液中中性粒细胞的含量及细胞因子TNF-α、IL-1β的产生，这与课题组前期利用兔子进行观察的结果一致［12］，表明痛风宁颗粒具有明显的抗炎、镇痛作用；痛风宁颗粒能够显著抑制TLR-2、TLR-4及MyD88 mRNA表达，正常组与模型组比较具有显著性差异（P＜0.05），提示痛风宁颗粒对急性痛风性关节炎的抗炎、镇痛作用可能是通过抑制TLR-2、4及 MyD88基因的激活，进而减少 TNF-α、IL-1β的生成有关。本研究还显示：秋水仙碱可以抑制TLR-2、TLR-4及MyD88 mRNA表达，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05），但其结果显著高于正常组及痛风宁颗粒组，这表明秋水仙碱抗炎、镇痛的作用机制与痛风宁颗粒作用机制有所不同，需要进一步研究。

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