Cdk5抑制剂Roscovitine对糖尿病大鼠肾功能及nestin表达的影响

张 悦，周 毅，张 怡，刘 巍

(1.河北医科大学病理学教研室，2.河北省肾脏病重点实验室，河北 石家庄 050017;3.河北医科大学附属第二医院内科，河北石家庄 050000;4.河北省保定市传染病医院，河北保定 070000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一。研究显示，足细胞损伤在糖尿病肾病的进展中发挥了重要作用［1－2］。Nestin是属于第Ⅵ类中间丝的细胞骨架蛋白，对维持足细胞的形态和功能起着重要作用［3－4］。我们前期研究［5－6］表明，高糖刺激的足细胞中，nestin表达降低，与足细胞损伤关系密切;细胞周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)参与了对足细胞nestin表达的调节。本实验拟通过腹腔注射Cdk5抑制剂Roscovitine，从体内进一步观察Cdk5对肾功能及nestin表达的影响，以明确Cdk5的作用机制，为糖尿病肾病的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar♂大鼠由河北医科大学实验动物中心提供。Roscovitine和链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购自Sigma公司。鼠Nestin单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗pnestin抗体购自Santa Cruz公司。二步法抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒购自Gene Tech公司;辣根过氧化物酶标记羊抗鼠/兔IgG购自北京中杉金桥公司。ECL发光试剂盒购自Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型制备及分组 Wistar大鼠25只，随机分为两组:正常对照组(Control组，n=5)、糖尿病组(DM组，n=20)。DM组大鼠一次性腹腔注射 STZ 65 mg·kg－1［7］，48 h 后测血糖≥16.7 mmol·L－1且尿糖阳性者为造模成功。DM组大鼠随机分为4组(n=5):DM组;DMSO处理组(DM+D组);Roscovitine低剂量处理组(DM+R-L组);Roscovitine高剂量处理组(DM+R-H组)。DM+D组每日腹腔注射400 μl DMSO;DM+R-L组和DM+R-H组每日分别按2.8和5.6 mg·kg－1腹腔注射 Roscovitine(溶于400 μl DMSO 中)。

1.2.2 标本留取 成模后第16周末处死大鼠。处死前1 d称重，收集24 h尿液，记录尿量。股动脉取血用于生化指标检测;麻醉后开腹取双侧肾脏，称重。左侧肾脏用于透射电镜和组织病理检测;右侧肾脏取皮质－80℃保存备用。

1.2.3 生化指标测定 日立7170-A全自动生化分析仪检测血糖(Glu)、尿素氮(BUN)、24 h尿蛋白(Alb)。以肾重(Kidney weight，KW，mg)与体重(Body weight，BW，g)比值作为肾脏指数(Kidney Index，KI)。

1.2.4 常规病理学观察 肾组织石蜡包埋，PAS染色，光镜下观察肾组织形态学改变。

1.2.5 免疫组化检测nestin在肾小球的表达 采用二步法免疫组化试剂盒，操作步骤参照说明书。每张切片选取10－15个肾小球，经Image-Pro Plus 6.0软件进行半定量分析，得出每个肾小球的积分光密度值(IOD)，取其平均值为该标本的nestin阳性表达值。

1.2.6 肾小球的分离与提取 剪碎肾皮质，分别经80目、

140 目和200目不锈钢筛网过滤，收集筛网上的物质，离心

后所得沉淀物为肾小球。

1.2.7 Western blot检测肾小球中 nestin和p-nestin的表达提取肾小球总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达。以β-actin作为内参。各条带信号强度应用LabWork45图像分析软件进行定量分析，测定其吸光度值(IOD)。

Tab 1Physical and metabolic parameters among different groups(±s)

Tab 1Physical and metabolic parameters among different groups(±s)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs DM group;△P＜0.05 vs DM+D group.

Group BW/g KW/mg KI/mg·g－1 Glu/mmol·L －1 BUN/mmol·L －1Alb/mg Control 416 ±34 1037 ±82 2.49 ±0.19 7.81 ±1.24 6.74 ±1.25 1.28 ±0.14 DM 263 ±34* 1348 ±69* 5.17 ±0.54* 33.39 ±1.71* 21.08 ±2.46* 9.69 ±1.77*DM+D 269 ±28* 1299 ±64* 4.83 ±0.74* 34.11 ±1.49* 20.36 ±2.68* 8.79 ±2.25*DM+R-L 256 ±37* 1356 ±101* 5.30 ±0.29* 31.20 ±2.57* 17.12 ±3.01*#△ 5.96 ±2.13*#△DM+R-H 262 ±30* 1296 ±85* 5.08 ±0.21* 32.01 ±1.82* 17.61 ±2.49*#△ 5.49 ±2.28*#△

2 结果

2.1 一般情况 DM组体重明显降低，KI、Glu、BUN和Alb明显升高(P＜0.05)。Roscovitine处理后，与 DM组相比，BUN和Alb明显降低(P＜0.05)，KI和Glu无明显变化，低剂量和高剂量两组间各指标无明显差异(Tab 1)。

2.2 肾组织形态学观察 PAS染色，DM组出现明显的肾小球肥大、系膜区增宽，系膜细胞增生和基质增多。电镜显示，DM大鼠肾小球基底膜不规则增厚，足细胞大量足突融合增宽。Roscovitine处理后，上述病变明显减轻。

2.3 肾小球中nestin和p-nestin蛋白的表达 免疫组化和Western blot结果均显示，DM组大鼠肾小球中nestin表达降低，p-nestin表达增高;Roscovitine可逆转上述结果。低剂量和高剂量两组间相比无明显差异(Tab 2)。

Tab 2 Effects of Roscovitine on nestin and p-nestin protein expression in kidney of different group rats(±s)

Tab 2 Effects of Roscovitine on nestin and p-nestin protein expression in kidney of different group rats(±s)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs DM group;△P＜0.05 vs DM+D group.IHC:Immunohistochemisty;WB:Western blot.

Group Nestin/IHC，IOD Nestin/WB，IOD p-nestin/WB，IOD Control 141.49 ±15.77 1.07±0.09 0.25 ±0.01 DM 59.48 ±6.18* 0.17±0.03* 0.88 ±0.04*DM+D 61.38 ±6.79* 0.21±0.03* 0.82 ±0.07*DM+R-L 92.39 ±12.27*#△ 0.64±0.07*#△ 0.51 ±0.03*#△DM+R-H 88.24 ±17.56*#△ 0.69±0.17*#△ 0.52 ±0.09*#△

3 讨论

Cdk5是细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK)家族成员，与其亚基p35结合而被激活，通过磷酸化底物而发挥其生物学作用。Roscovitine可通过选择性替代CDK与ATP结合部位上的腺嘌呤，由于其与Cdk5的亲和性较高，而被作为Cdk5/p35的高效特异性抑制剂。本实验我们采用体内注射Roscovitine干预糖尿病大鼠，发现BUN和尿白蛋白水平明显降低;肾小球系膜区增生、基质沉积和基底膜病变明显减轻;足细胞足突融合减轻。提示Roscovitine可在一定程度上减轻糖尿病大鼠肾脏病变及肾功能损伤。

作为一种重要的细胞骨架蛋白，nestin对维持细胞正常形态和功能具有重要作用。Cdk5与nestin在肾小球中有共定位表达，二者关系密切［8］。本研究中，Roscovitine可升高nestin表达水平，降低p-nestin的表达。因此我们推测Roscovitine减轻糖尿病大鼠肾功能的损伤，其机制可能与抑制Cdk5后，减少nestin磷酸化并增强其生物学功能有关。对Roscovitine的深入研究，将为糖尿病肾病的防治开拓一条新的思路。

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